گرایش میکروبیولوژی

عنوان

جداسازی هم زمان ژن‏های عامل مقاومت افزایش یافته به آمینوگلیکوزیدهاaac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia ، ant(4)-Іa،aph(3ʹ)-IIIa  در انتروکوک های ایزوله شده از بیماران شهر تهران با روش مولکولی Triplex-PCR

استاد راهنما

دکتر رضا میرنژاد

دی‏ماه 93

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود (در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است) تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)   فهرست مطالب عنوان                                                                                                                        صفحه چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 1 فصل اول – مقدمه 1-1- بیان مسأله………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2 1-2- ضرورت انجام تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………. 3 1-3-اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3 1-4-فرضیه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4 1-5-تعریف واژه‏ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 4 فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده 2-1-تاریخچه باکتری انتروکوک………………………………………………………………………………………………………………………….. 5 2-2-تاکسونومی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7 2-3-فاکتورهای بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………….. 8 2-3-1-مواد تجمعی…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 9 2-3-2-سیتولیزین………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 9 2-3-3-ژلاتیناز………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 10 2-3-4-فرمون………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 10 2-3-5-لیپوتیکوئیک اسید………………………………………………………………………………………………………………………………… 10 2-3-6-همولیزین انتروکوکوس فکالیس…………………………………………………………………………………………………………… 11 2-3-7-آنتی ژن آندوکاردیتی انتروکوکوس فکالیس…………………………………………………………………………………………… 11 2-3-8-پروتئین سطحی انتروکوکی (ESP )……………………………………………………………………………………………………… 11 2-3-9-ادهسین کلاژن انتروکوکوس فکالیس (ACE )………………………………………………………………………………………. 12 2-4-بیماری زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12 2-4-1-باکتریمی……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12 2-4-2-عفونت های مجاری ادراری…………………………………………………………………………………………………………………. 13 2-4-3-اندوکاردیت…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 13 2-4-4-عفونت های داخل شکمی، لگنی وبافت های نرم………………………………………………………………………………….. 13 2-4-5-سایر عفونت های انتروکوکی……………………………………………………………………………………………………………….. 14 2-5-شناسایی انترکوک‏ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 14 2-6-درمان انترکوک‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15 2-6-1-مقاومت آنتی بیوتیکی…………………………………………………………………………………………………………………………… 16   2-6-1-1-مقاومت به گلیکوپپتیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 17 2-6-1-1-الف- عوامل زمینه ساز کلنیزاسیون انتروکوک های مقاوم به ونکومایسین(VRE)……………………………… 17 2-6-1-2-مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام……………………………………………………………………………………………… 19 2-6-1-3-مقاومت به آنتی بیوتیک های تتراسایکلین……………………………………………………………………………………….. 20 2-6-1-4-مقاومت به لینکوزامیدها………………………………………………………………………………………………………………….. 20 2-6-1-5-مقاومت به استرپتوگرامین B وA……………………………………………………………………………………………………… 21 2-6-1-6-مقاومت به اگزازولیدون…………………………………………………………………………………………………………………… 21 2-6-1-7-مقاومت به اورنی مایسین………………………………………………………………………………………………………………… 22 2-6-1-8-مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های ماکرولیدی…………………………………………………………………………………. 22 2-6-1-9-مقاومت به کلرامفنیکل…………………………………………………………………………………………………………………….. 23 2-6-1-10-مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………………………. 24 2-6-1-10-الف- تاریخچه روند گسترش مقاومت های آمینوگلیکوزیدی……………………………………………………….. 25 2-6-1-10-ب- انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها…………………………………………………………………………………………. 25 2-6-1-10-پ- اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی………………………………………………………………………………………….. 27 2-6-1-10-ت-HLAR و و افزایش مرگ ومیر……………………………………………………………………………………………….. 28 2-6-2-مقاومت چنددارویی( MDR)……………………………………………………………………………………………………………….. 28 2-7- روش های شناسایی سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک……………………………………………………………………………….. 29 2-7-1- روش های مبتنی بر فنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 29 2-7-1-1- روش انتشار دیسک در آگار( دیسک دیفیوژن)……………………………………………………………………………….. 29 2-7-1-2- روش تهیه رقت در محیط مایع( براث دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30 2-7-1-3 – روش تهیه رقت در محیط آگار( آگار دیلوشن )…………………………………………………………………………….. 30 2-7-2- روش های مبتنی بر ژنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………… 31 2-7-2-1-Triplex-PCR……………………………………………………………………………………………………………………………….. 31 2-7-2-1-الف-طراحی واجرایTriplex-PCR……………………………………………………………………………………………….. 32 2-7-2-1-ب-تیتراسیون اجزای واکنش………………………………………………………………………………………………………….. 33 2-7-2-1-3 -شرایط ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………………. 33 2-8-اپیدمیولوژی عفونت های انتروکوکی…………………………………………………………………………………………………………. 33 2-9-مروری بر پیشینه پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………….. 35 فصل سوم – مواد و روش‏ها 3-1-وسایل موردنیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 40 3-2-مواد موردنیاز……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 41 3-3-طریقه ساخت محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………… 43 3-3-1-محیط بلادآگار…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43 3-3-2-محیط BHI براث…………………………………………………………………………………………………………………………………. 43 3-3-3-محیط مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………………………………………………….. 44 3-3-4-محیط پایه قند……………………………………………………………………………………………………………………………………… 44 3-4-جمع آوری نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………………… 45 3-5-جدا سازی سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 45 3-6-نگهداری سویه ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 46 3-7-آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 46 3-7-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………….. 46 3-7-2-روش آنتی بیوگرام……………………………………………………………………………………………………………………………….. 47 3-8-بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین……………………………………………………………………. 48 3-9-اجرای PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 48 3-9-1-آماده سازی واستخراج ژنوم………………………………………………………………………………………………………………….. 48 3-9-1-1-جوشاندن………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49 3-10-اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده……………………………………………………………………………………. 49 3-11-الکتروفورز محصول استخراج ژنوم…………………………………………………………………………………………………………. 50 3-12-انتخاب و سنتز پرایمر…………………………………………………………………………………………………………………………….. 50 3-13-روش آماده سازی پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………… 51 3-13-1-محلول کاری پرایمر PCR…………………………………………………………………………………………………………………. 51 3-13-2- ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه…………………………………………………………………………………………………. 52 3-14-انجام واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………. 52 3-15-طریقه ساخت بافر…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54 3-15-1-تهیه بافر(SX )TBE…………………………………………………………………………………………………………………………… 54 3-15-2-تهیه ژل Buffer  Loading  Gel……………………………………………………………………………………………………. 54 3-16-تهیه ژل الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………… 55 3-16-1-تهیه‌ی ژل آگاروز جهت انجام الکتروفورز  ژنوم اسنخراج شده و محصول PCR…………………………………. 55 3-17-تعیین توالی……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 55 فصل چهارم – نتایج و بحث 4-1-نتایج مربوط به جداسازی گونه های انتروکوکی از نمونه های بالینی………………………………………………………….. 56 4-2-نتایج حاصل از کشت انتروکوک ها بر روی محیط و رنگ آمیزی گرم……………………………………………………….. 57 4-3-نتایج حاصل از حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن………………………………………………………………. 61 4-4-نتایج حاصل از استخراج…………………………………………………………………………………………………………………………… 61 4-5-نتایج PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 62 4-6-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 66 فصل پنجم – نتیجه‏گیری 5-1- نتیجه‏گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 71 5-2-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 72 منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73 منابع غیرفارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 73 چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 84 فهرست جدول‏ها عنوان                                                                                                                        صفحه جدول(3-1) اجزای تشکیل دهنده محیط بلاد آگار…………………………………………………………………………………………….. 43 جدول(3-2) اجزای تشکیل دهنده ی محیط BHI براث……………………………………………………………………………………… 43 جدول(3-3) اجزای تشکیل دهنده محیط مولر هینتون آگار………………………………………………………………………………… 44 جدول(3-4) اجزای تشکیل دهنده محیط پایه قند………………………………………………………………………………………………. 44 جدول(3-5) مشخصات دیسک های آنتی بیوتیکی استفاده شده………………………………………………………………………….. 48 جدول(3-6) پرایمرهای استفاده شده برای پیدا کردن به سویه های انتروکوکی مقاوم به آمینوگلیکوزیدی…………….. 50 جدول( 3-7)محلول کاری جهت پرایمر  aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia………………………………………………………………….. 51 جدول( 3-8 )محلول کاری جهت پرایمر  aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………………………………………. 51 جدول (3-9 )محلول کاری جهت پرایمر  ant(4)-Іa………………………………………………………………………………………… 51 جدول( 3-10) محلول کاری جهت PCR…………………………………………………………………………………………………………… 52 جدول(3-11) برنامه PCR  بهینه سازی شده برای جفت پرایمر aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia……………………………….. 53 جدول(3-12)برنامه PCR  بهینه سازی شده برای جفت پرایمر aph(3ʹ)-IIIa……………………………………………………. 53 جدول(3-13) برنامه PCR  بهینه سازی شده برای جفت پرایمر ant(4)-Іa……………………………………………………….. 54 جدول( 3-14) اجزای تشکیل دهنده بافر TBE………………………………………………………………………………………………….. 54 جدول(3-15) اجزای تشکیل دهنده ژل لودینگ بافر………………………………………………………………………………………….. 53 جدول( 4-1) درصد فروانی انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم در نمونه های بالینی…………………………… 60 جدول(4-2) درصدفراوانی سویه های انتروکوک  حاوی یک ژن در نمونه های بالینی…………………………………………. 64 جدول(4-3) درصدفراوانی سویه های انتروکوک حاوی بیش از یک ژن در نمونه های بالینی………………………………. 66 فهرست نمودارها عنوان                                                                                                                        صفحه نمودار(4-1) درصد فراوانی انتروکوک های جداسازی شده از نمونه های بالینی………………………………………………….. 57 نمودار(4-2) نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های انتروکوکی…………………………………………. 61 فهرست شکل‏ها عنوان                                                                                                                        صفحه شکل( 4-1) کشت در محیط5/6 درصد BHI Broth Nacl……………………………………………………………………………… 57 شکل(4-2) کشت روی محیط بلاد آگار ……………………………………………………………………………………………………………. 58 شکل(4-3 )رنگ آمیزی گرم انتروکوک و مشاهده توسط میکروسکوپ با بزرگنمایی 100X………………………………. 58 شکل(4-4) محیط کشت لاکتوز…………………………………………………………………………………………………………………………. 59 شکل(4-5) محیط کشت آرابینوز جهت افتراق دو گونه انتروکوک……………………………………………………………………… 59 شکل(4-6)  محیط کشت آرابینوز عدم رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس………………………………………………………….. 60 شکل(4-7) الکتروفورز  نمونه‌های DNA  استخراج شده با روش جوشاندن بر روی ژل آگارز 1…………………………. 61 شکل(4-8) نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ……………………………. 62 شکل(4-9) نتایج حاصل از الکتروفورز ژن aac(6ʹ)-Ie-aph(2ʹʹ)-Ia و aph(3ʹ)-IIIa…………………………………….. 63 شکل(4-10) نتایج حاصل از الکتروفورز از ژن ant(4)-l a……………………………………………………………………………….. 64 شکل(4-11) نتایج حاصل از الکتروفورز از ژن های مورد بررسی به روش Triplex-PCR…………………………………. 65

چکیده

انتروکوک ها جز فلور طبیعی دستگاه گوارش انسان می‏باشند و به عنوان یک پاتوژن فرصت طلب باعث عفونت های بیمارستانی به ویژه در بخش مراقبت های ویژه(ICU)  می گردد. این باکتریها به طور ذاتی یا با دریافت اجزا خارج ژنتیکی از طریق پلاسمید یا بر اثر موتاسیون های مختلف می توانند از خود مقاومت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام و آمینوگلیکوزیدها نشان دهند. در انتروکوک ها ژن های  aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia aph(3′)-IIIa  و ant(4)-Іa نقش اصلی در پیدایش مقاومت نسبت به آمینوگلیکوزیدها را بازی می کنند. با توجه به اینکه در ایران میزان فراوانی ژن های فوق درانتروکوکوس فکالیس و فاسیوم مشخص نمی باشد این مطالعه با هدف بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ،  ant(4)-Іa ، aph(3′)-IIIa در انتروکوک های ایزوله شده از بیماران شهر تهران اجرا می گردد. 350 نمونه بالینی مختلف در طی سال های 1393-1392 از  بیمارستان امام خمینی ، میلاد و بقیه ا…(عج) جمع آوری شد. تعیین هویت  هر ایزوله توسط  تست های بیوشیمیایی مشخص گردید. الگوی مقاومت دارویی با استفاده از دیسک های آنتی بیوتیکی جنتامایسین، استرپتومایسین و سایر آمینوگلیکوزیدها از روش دیسک دیفیوژن بر اساس معیار CLSI  انجام پذیرفت. پس از استخراج ژنوم از هر نمونه با استفاده از پرایمرهای  aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia و  aph(3′)-IIIa  و،  ant(4)-Іa روش Triplex-PCR انجام گردید. از میان 150 نمونه مورد بررسی، (58%) انتروکوکوس فکالیس و (42% ) انتروکوکوس فاسیوم گزارش شدند.  نتایج حاصل از تست آنتی بیوگرام، بدین صورت بود که 38% جنتامایسین،25% استرپتومایسین، 6/57% تتراسایکلین، 75/43% اریترومایسین، 25/6% ونکومایسین، 27/15%کلرامفنیکل  و 47/28% سیپروفلوکساسین مقاومت نشان دادند. حضور ژنهای aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ،  ant(4)-Іa ، aph(3′)-IIIa با مقاومت چندگانه دارویی در انتروکوک ها از نظر آماری معنی دار بود. پس از انجام واکنش PCR جهت تکثیر ژن های مذکور، مشخص شد که9/56% از نمونه ها دارای ژن  aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia،22% نمونه ها دارای ژن aph(3′)-IIIa و 8/38% دارای ژن  ant(4)-Іa بودند که 8% از نمونه ها حامل سه ژن مقاومت گزارش شدند. نتایج این مطالعه نشان داد که میزان فراوانی ژنهای aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ،  ant(4)-Іa ، aph(3′)-IIIa در سویه های انتروکوکوس فاسیوم و فکالیس  بالا بوده لذا تشخیص سریع این نوع مقاومت ها به روش های مولکولی بر پایه PCRTriplex- می تواند راهی برای جلوگیری از گسترش  عفونت های ناشی از این باکتری باشد.