تاثیر عصاره برگ  گیاه جغجغه(prosopis farcta) بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز-1در موش های صحرایی دیابتی (نوع 1)

اساتید راهنما:

دکتر حمیدرضا میری

دکتر محمد رضا حاجی نژاد

اساتید مشاور:

مهندس داوود نادری

مهندس هادی صبوری

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود (در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است) تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است) فهرست مطالب: فصل اول: مقدمه وکلیات 1-1- مقدمه-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 2 2-1-کلیات تحقیق————– 3 1-2-1-دیابت-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 3 2-2-1- انواع دیابت————- 3 3-2-1- علائم بروز دیابت——– 4 4-2-1- درمان دیابت :———- 5 3-1- گیاه جغجغه (Prosopis farcta)————- 8 1-3-1- خواص دارویی جغجغه— 8 4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):—————- 9 5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :– 13 فصل دوم: مروری بر منابع 1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان— 16 1-1-2- انار-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 17 2-1-2-مكانیسم اثر انار در دیابت:—————- 17 2-1-2- سیر-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 19 2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن- 21 فصل سوم: مواد و روشها 1-3- موادو روشها————- 25 2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27 3-3- حیوانات آزمایشگاهی—— 28 1-3-3- نحوه گروهبندی:——- 28 2-3-3- روش القای دیابت تجربی:—————- 29 3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———— 29 4-3-3- مراحل انجام تشریح:—- 29 4-3- بررسی بیان ژن———- 31 1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31 2-4-3- طراحی پرایمرها——- 35 3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35 5-3- استخراج RNA:———- 36 1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm   1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 38 6-3- سنتز cDNA———— 1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 7-3- واکنش های PCR——– 1-7-3 – PCR شیب دمایی—– 41 2-7-3- PCR معمولی——— 43 8-3- الکترفورز————— 45 1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45 1-1-8-3- آگارز————– 45 2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—— 46 3-1-8-3- لودینگ بافر——— 46 4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl————- 4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————– 9-3- روش کار با ژل الکترفورز— 47 10-3- رسم منحنی استاندارد:— 48 10-3- واکنش Real-Time PCR—————- 11-3- Threshold و مقدار CT:– 12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——— 10-2-3- آنالیز بیان ژن——– 52 13-3- تجزیه وتحلیل داده ها—- 52 فصل چهارم: نتایج و بحث 1-4- جمع آوری نمونه :——– 54 2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه——- 54 3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 56 5-4- نتایج استخراج RNA:—– 6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 59 7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 61 1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——– 61 8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62 1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP————— 2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————- 9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR————- 1-9-4- تکثیر ژنPFK——— 2-9-4-تکثیر ژن TBP——— 10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:—— 66 1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———– 2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————– 12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP————— 13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 70 14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70 15-4- بحث:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 71 16-4- پیشنهادات————- 73 منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75 چکیده: دیابت قندی یكی از مشكلات مهم پزشكی در همه كشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل­های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی كه داروهای شیمیایی ممكن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد كنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می­توان راه­های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم. در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش­های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه­گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروهها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد. فصل اول: مقدمه و کلیات 1-1- مقدمه دیابت یک بیماری ساده نیست، بلکه سندرم پیچیده­ای است که بارزترین ویژگی آن افزایش قند خون است. بنابراین، بیماران دیابتی هر چند در یک ویژگی به هم می­مانند، اما هم از نظر بالینی و هم از نظر آسیب شناسی و ژنتیکی ناهمگون هستند. این بیماری در سال 1980 میلادی این گونه تعریف شد: گروهی از نارسایی­ها که ویژگی اصلی آن­ها افزایش بیش از اندازه­ی گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پیامد کمبود انسولین یا نارسایی در کارکرد انسولین و یا آمیزه­ای از این دو است. عوارض ناشی از دیابت در 25% موارد، نارسایی کلیه و در 50% موارد قطع عضو و نابینایی است (Tehranipour et al., 2008). گیاهان دارویی از قدیم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزایش کیفیت و طول زندگی در افراد دیابتی به کار گرفته شده است. با توجه به این که گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی اثر جانبی کمتری دارند، بنابراین پژوهشگران به دنبال یافتن ترکیبهای گیاهی برای درمان و یا پیشگیری از این بیماری هستند. گیاه جغجغه (Prosopis farcta) گیاهی با خواص ضد التهاب و ضد دیابتی است. اهمیت فعالیت فسفوفروکتوکیناز 1 نه تنها از این جنبه است که واکنشی به شدت انرژی زا را کنترل می کند بلکه اولین مرحله در واکنش­های گلیکولایزیز است که واکنش یکطرفه بوده و برگشت ناپذیر است. این باعث می­گردد که کنترل شدیدی بر روی میزان گلوکز و دیگر مونوساکاریدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آید.. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر میزان بیان ژن پیروات کیناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌های صحرایی نر دیابتی می‌باشد. 2-1- کلیات تحقیق 1-2-1- دیابت دیابت ملیتوس شامل بیماریهای متابولیکی است که مشخصه آن افزایش مزمن قند خون و اختلالات متابولیسم کربوهیدرات­ها، چربی­ها و پروتئین­ها می باشد. این بیماری در نتیجه­ی وجود نقص در ترشح انسولین، عملکرد انسولین یا هر دو ایجاد می­گردد. افزایش مزمن قند خون در حالت ناشتا یا بعد از خوردن غذا مسئول عمده­ی  عوارض کوتاه اثر و بلند مدت این بیماری می باشد که تمام سیستم­ها و اندام­های بدن را تحت تاثیر قرار میدهند. این بیماری شایعترین علت بیماریهای کلیوی مرحله نهایی، موارد جدید نابینایی و قطع اندام تحتانی غیرترومایی را به خود اختصاص می­دهد. بیماری قلبی عروقی در افراد دیابتی 2 تا 4 برابر نسبت به افراد عادی شایعتر  است و در افراد بالاتر از 25 سال 18٪ تمام بیماری­ها را شامل می­ گردد. 2-2-1- انواع دیابت دیابت به دو دسته­ی اصلی وابسته به انسولین (دیابت نوع 1) و دیابت غیر وابسته به انسولین (دیابت نوع 2) تقسیم می­شود. همچنین گونه دیگر با نام دیابت بارداری (Gestational) که در دوران بارداری بروز کرده و پس از آن بهبود می یابد. در دیابت نوع 1  که از انواع شایع بیماریهای  خود ایمن  است سیستم ایمنی بدن سلول­هایβ سازنده انسولین در پانکراس را تخریب می­کند. این نوع دیابت بسیار سریعتر از سایر فرم­های دیابت پیشرفت می­کند و معمولا در کودکان و نوجوانان بالغ، بعضی اوقات در جوانان بالغ دیده می­شود. این بیماران باید بطور منظم انسولین تزریق کنند. همچنین به این دیابت، دیابت جوانان یا دیابت ملیتوس وابسته به انسولین نیز می­گویند. اما این اصطلاح نمی­تواند کاملا دقیق باشد برای اینکه این کودکان می­توانند به سایر فرم­های دیابت مبتلا شوند. یک فرم دیگر از دیابت نوع 1 که در سنین بالا معمولا بعد از سی سالگی رخ می­دهد LADA[1]گفته می­شود. افراد مبتلا به این نوع دیابت فاقد شاخص­های ایمونولوژیکی هستند که حاکی از روند تخریب خود ایمنی سلول­های β باشد با  این وجود این بیماران بواسطه­ی مکانیسم­های نامشخصی دچار کمبود انسولین می­شوند. گاهی اوقات بیماران مبتلا به دیابت اتوایمیون به دلیل افزایش وزن و فاکتورهای ژنتیکی به انسولین مقاوم می­شوند به این شرایط دیابت مضاعف[2]گفته می­شود. فاکتورهای قابل کنترلی مانند شیوه زندگی ناسالم، پرخوری، کم تحرکی، چاقی، می­توانند توانایی بدن را در استفاده از انسولین مختل کنند. همچنین فاکتورهای غیر قابل کنترلی مانند ژنتیک، تاریخچه­ی خانوادگی دیابتی، سن نیز در این فرایند درگیرند. فرم­های متابولیک دیابت شامل دیابت بارداری و دیابت نوع 2 می­باشند. بیماری دیابت بارداری، فرم موقت دیابت است و در دوران بارداری در هر زن غیردیابتی می­تواند رخ دهد. تغییرات هورمونی، همراه با وزن زیاد و تاریچه خانوادگی دیابتی در ابتلا به این بیماری نقش دارند. بر اساس گزارش موسسه آمریکایی دیابت حدود 4% از زنان در طول دوران بارداری به این فرم از دیابت مبتلا می­شوند. این بیماری می­تواند مشکلاتی مانند تولد جنین نارس، یرقان و مشکلات تنفسی برای مادر و کودک ایجاد کند. این بیماری بعد از زایمان بهبود می­یابد ولی مادر و کودک در سنین بالاتر استعداد ابتلا به دیابت نوع 2 را دارند (Riaz, 2009). دیابت نوع 2 شایعترین نوع دیابت بوده و90٪ موارد بیماری دیابت را به خود اختصاص داده است. شیوع دیابت نوع 2 پیوسته در حال افزایش است و میزان بروز دیابت نوع 2 در کودکان تقریبا ده برابر شده است. 1-2-3- علائم بروز دیابت علایم بروز دیابت، به نوع دیابت و اینکه فرایند بیماری در چه مرحله­ای باشد بستگی دارد. مبتلابان به دیابت نوع 1 معمولا با علایم حاد کلاسیک هیپرگلیسمی شامل: پرنوشی، پرادراری، کاهش وزن و به میزان کمتر پرخوری، تاری دید و خارش مراجعه می­کنند. در بیست و پنج درصد مبتلایان نشانه بروز بیماری برای اولین بار کتواسیدوز دیابتی است. در مبتلایان به دیابت نوع 2 اغلب چندین سال قبل از تشخیص بیماری وجود دارد. معمولا علائم نسبت به نوع 1 کمتر به صورت حاد بروز می­کند و ممکن است در افراد مسن­تر همراه با لتارژی و خستگی دیده شود. افزایش مزمن قند خون ممکن است با اختلال رشد، حساس بودن به عفونتها و ترمیم تاخیری زخم همراه می­باشد. برخلاف بیماری­های تک ژنی، بروز بیماری توسط آلل موتانت در یک جایگاه ژنی تحت تاثیر قرار می­گیرد، در بیماری­هایی شبیه به دیابت نوع 2 بروز بیماری به چندین جایگاه ژنی که دارای اثر کوچک تا متوسط هستند، بستگی دارد. دیابت نوع 2، بیماری چند عاملی است که در آن ژنها نه تنها با یکدیگر، بلکه با عوامل محیطی نیز در تعامل اند. این احتمال وجود دارد که فعالیت و ترشح انسولین هر دو تحت کنترل واریانت­های ژنتیکی در جایگاه­های ژنی مختلف باشند. براساس مدل مولتی فاکتوریال، استعداد ابتلا به بیماری می­تواند به وسیله­ی ترکیبی از واریانت­های ژنتیکی متعدد و فاکتورهای محیطی تعیین شود. استعداد ژنتیکی افراد لزوما باعث سندروم آشکار نمی­شود مگر اینکه آنها در معرض عوامل محیطی ویژه­ای قرار گیرند. 1-2-4- درمان دیابت کمیته متخصصین سازمان بهداشت جهانی در سال 1980 توصیه کرده است که روش­های سنتی درمان دیابت، بیشتر مورد بررسی قرار گیرند، زیرا مرگ ناشی از دیابت در حال افزایش بوده و همچنین مشکلاتی در استفاده از داروهای رایج فعلی وجود دارد (Suba et al., 2004).  به طور سنتی در طول تاریخ از گیاهان متفاوتی برای کاهش قندخون و بهبود اثرات دیابت، استفاده شده و در طب سنتی ایران و سایر کشورهای جهان، اطلاعات کمابیش مفصلی در این رابطه به چشم می­خورد. داروهای گیاهی به خاطر کم بودن اثرات جانبی، در دسترس بودن، هزینه نسبتا کم و مؤثر بودن­ آنها، به طور وسیع در سرتاسر جهان مورد تجویز واقع می­شوند (Venkates et al., 2003). چندین نوع داروی کاهش دهنده گلوکز وجود دارد که از طریق مکانیزم­های مختلف، اثرات ضد­دیابتی خود را اعمال می­کنند. از جمله این مکانیسم­ها می­توان به تحریک ترشح انسولین توسط داروهای خانواده سولفونیل اوره و مگلیتینیدها (Meglitinides)، افزایش جذب محیطی گلوکز توسط بای­گوانیدها (Biguanides) و تیازولیدین­دیون­ها (Thiazolidinediones)، به تأخیر انداختن جذب کربوهیدرات­ها از روده توسط مهارکننده­های آلفا_ گلوکوزیداز، کاهش گلوکونئوژنز کبدی توسط بای­گوانیدها و تیازولیدین­دیون­ها (Modi, 2007)، افزایش غلظت سرمی GLP-1[1] و کاهش خالی شدن معده توسط آنالوگ­های پپتیدی جدید مانند اگزناتیدها (Exenatide) و لیراگلوتیدها (Liraglutide) و مهارکننده­های [2]DPP-4 اشاره کرد (Hui et al., 2005). این درمان­ها دارای معایبی نظیر توسعه­ی مقاومت دارویی، اثرات جانبی و حتی سمی بودن تا کمبود پاسخ­دهی می­باشند. به عنوان مثال سولفونیل اوره­ها در مدت 6 سال کارایی خود را در 44 درصد بیماران از دست می­دهند. 3/2 از داروهای تجویز شده برای کودکان مؤثر نیستند ( Michal et al., 2005 and Defronzo, 1999). به علاوه هیچ کدام از این داروهای کاهش دهنده­ی گلوکز به طور مؤثر افزایش لیپیدهای خون را کنترل نمی­کنند (Derek, 2001). با شیوع در حال افزایش دیابت در جمعیت روستایی و به علت اثرات نامساعد داروهای صناعی، یک نیاز آشکار برای توسعه­ی منابع گیاهی طبیعی برای داروهای ضد دیابت وجود دارد (Venkatesh et al., 2003). همچنین اثرات جانبی داروها و تداخلات آنها با یکدیگر که در بدن انسان یا در هنگام آزمایش­های مختلف آشکار می­شود نیز مسأله مهمی است که باید مدنظر باشد (Bathaie et al., 2001). مواد مؤثر موجود در گیاهان دارویی مختلف، از طریق مکانیزم­های متفاوتی قادر به کاهش قند خون هستند. عمده­ی این مکانیزم­ها عبارتند از: افزایش ترشح انسولین، فعال کردن مسیر کاتابولیسم گلوکز، مهار یا غیر فعال کردن مسیر گلوکونئوژنز، هدایت گلوکز به داخل سلول، جذب گلوکز آزاد و ممانعت از اتصال آن به پروتئین­ها، افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانی و ممانعت از آسیب­زایی اکسیدان­های تولید شده در مسیرهای مختلف که ممکن است ناشی از ازدیاد گلوکز و تولید محصولات نهایی گلیکه یا سایر مسیرهای متابولیک باشد و سرانجام ممانعت از جذب گلوکز از روده. (بطحایی و همکاران، 1391). یکی از مهمترین مسائل مورد توجه در علوم پزشکی و حتی تجارت جهانی به تولید، فرآوری و استفاده از گیاهان دارویی می­باشد (Pirzad et al., 2006).  به ­طوریکه بعد از اسلحه سازی دومین صنعت پول ساز بزرگ جهان تولید و تجارت داروئی می­باشد (Riazi,1997).در سال 2008 سرمایه در گردش بازار جهانی گیاهان دارویی تا سال 2005 بالغ بر 5 تریلیون دلار گردد (امید بیگی، 1379). چین سالانه 8 میلیارد دلار از تولید گیاهان دارویی در­آمد کسب می­کند. در ایران با وجود حجم عظیم منابع گیاهان دارویی، بخشی از نیاز جامعه از کشورهایی مثل هند وارد می­شود (افشار، 1385). در حال حاضر سطح زیرکشت گیاهان دارویی در ایران 91 هزار هکتار و میزان تولید این محصولات 100 هزار تن است. صادرات گیاهان دارویی ایران در سال 1384 کمتر از 40 میلیون دلار بود (افشار، 1385). در حالیکه در سال 1387حجم مبادلات دارویی ایران به 89 میلیون دلار رسید (زمانی و همکاران، 1387). بشر همواره جهت رفع نارسائی­ها و بیماریهای خود نیاز به استفاده از داروهای طبیعی داشته و دارد. اهمیت تولید و فرآوری گیاهان دارویی بدلیل عوارض جانبی کمتر، عدم توانایی در تولید برخی داروها و همچنین هزینه بالای تولید بسیاری از مواد دارویی، روز به روز در حال افزایش است و بیشتر کشورها سرمایه گذاری زیادی را در راستای تولید گیاهان دارویی انجام داده­اند (letchamo, 2006). در حال حاضر یک سوم داروهای مورد استفاده بشر را داروهای با منشاء گیاهی تشکیل می­دهند و این میزان به شدت رو به افزایش است (امید بیگی، 1379).