دکتر حسین عباسپور

 استاد مشاور :

دکتر سکینه سعیدی سار

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود (در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است) تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است) چکیده : مقدمه: گیاه رازیانه (Foeniuculum vulgare) گیاهی علفی، پایا، معطر از خانواده چتریان است که در مناطق مختلف ایران مورد استفاده خوراکی و دارویی قرار می­گیرد. با توجه به اهمیت ترکیبات این گیاه در صنایع دارویی و غذایی هدف در این پژوهش بهینه سازی کشت بافت این گیاه تحت تیمارهای هورمونی و افزایش متابولیتهای ثانویه مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی تأثیر تیمارهای هورمونی بر کالزایی و باززایی در گیاه رازیانه، سه ریزنمونه ( برگ، هیپوکوتیل،  ریشه) انتخاب شد. بذر گیاه رازیانه در گام اول استریل شد در گام بعدی به محیط کشت MS پایه تحت شرایط کاملا استریل منتقل شد. بذور مورد نظر در اتاقک رشد در دمای 23 درجه سانتیگراد با 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شد و بعد از گذشت 21 روز که گیاه به ارتفاع حدود 10 سانتی متر رسید، ریز نمونه ها به منظور پرتوانی به محیط کشت دارای هورمون BAP 0.5 و 1 میلی­گرم برلیتر منتقل شدند. القای کالوس با کشت ریزنمونه­ها روی محیط  MS  با 16 تیمار هورمونی شامل هورمون 2,4-D به همراه BAP و NAA به همرا Kin انجام شد. اندازه کالوس، وزن کالوس و درصد کال­زایی در هر یک از تیمارهای به­کار رفته اندازه­گیری شد. با در نظر گرفتن صفات فوق هورمونی 2 و 4 میلی­گرم در لیتر 2,4-D به همراه  0.5 میلی­گرم در لیتر BAP بهترین ترکیب­های هورمونی و نیز هیپوکوتیل و ریشه بهترین ریزنمونه­ها شناخته شدند. در مرحله باززایی کالوس محیط ½ MS  بدون هورمون بهترین محیط باززایی را نشان داد. به منظور مطالعه تولید عصاره در فاز کشت سوسپانسیون سلولی بهترین تیمار در فاز کال­زایی انتخاب شد و کالوس به محیط سوسپانسیون سلولی MS مایع شامل 2,4-D (2 و 4 میلی­گرم در لیتر) به همراه BAP  (0.5 میلی­گرم در لیتر) منتقل و در شرایط تاریکی در دمای 24 درجه سانتیگراد روی شیکر با 120 دور دردقیقه قرار داده شدند. بعد از 2 هفته طیف نگاری جرمی انجام شد که تولید موادی همچون آلفا-پینن و لیمونن در محیط کشت بافت گزارش شد. فهرست مطالب فصل اول:  مقدمه                  ………………………………………………………………… 11 1-1- مقدمه………………………………………………………………………………………………………… 12 1 -2- جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران  …………………………………………………………  13 1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی…………………………………………………………………….   14 1-4-گیاه شناسی رازیانه  ………………………………………………………………………………………….   14 1-5- اندام دارویی                                    …… ………   ……   ……………………………………16 1-6- نیازهای اکولوژیکی                                           ………………………………………  …16 1-7- پراکنش جغرافیایی              ………   …… ……………………………………              16 1-8- آفات و بیماریها  …   …… …           …  …     ………             ………………………..18 1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده        ………………..……………………….18 1-10- پیاز رازیانه                                               …………………………………………  .    19 1-11- دانه رازیانه                                ………   ………………………………………………     20 1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان           …   …………………………………………….21 1-13- تاریخچه کشت بافت……………………………………………………………………………………….   23 1-14- مراحل تکنیک کشت بافت…………………………………………………………………………………. 24 1-15- انواع ترکیبات محیط کشت…………………………………………………………………………………. 26 1-16- ویتامین ها………………………………………………………………………………………………….   26 1-17- اسیدهای آمینه……………………………………………………………………………………………… 27 1-18- تنظیم کننده های رشد…………………………………………………………………………………….. 27 1-19- سایتوکنین………………………………………………………………………………………………….   28 1-20- اسید جیبرلیک……………………………………………………………………………………………… 28 1-21- آگار و دیگر مواد تولیدکننده ژل…………………………………………………………………………… 28 1-22- ترکیبات مورد استفاده در ضدعفونی مواد گیاهی…………………………………………………………..   29 1-23- استفاده از آنتی بیوتیک ها در رفع آلودگی های درون بافتی………………………………………………. 29 1-24- ضدعفونی محیط کشت…………………………………………………………………………………….. 30 1-25- قهوه ای شدن بافت های گیاهی……………………………………………………………………………   30 1-26- روش های ریزازدیادی………………………………………………………………………………………. 32 1-27- جنین زایی غیر جنسی…………………………………………………………………………………….. 32 1-28- کشت مرسیتم………………………………………………………………………………………………   33 1-29- باززایی………………………………………………………………………………………………………. 34   1-30- باززایی گیاهان کشت شده…………………………………………………………………………………. 34 1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشه ای ………………………………………………………..  35 1-32- استقرار در محیط کشت…………………………………………………………………………………….. 35 1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق کشت های متوالی……………………………………….   35 1-34- ریشه زایی گیاهچه های تولیدشده…………………………………………………………………………. 35 1-35- تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان در شرایط درون شیشه ای…………………………………………. 36 1-36- روش کشت کالوس…………………………………………………………………………………………   36 1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی…………………………………………………………………………… 37 1-38- اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………….. 38 فصل دوم: مروری بر منابع………………………………………………………………….. 39 2-1- سوابق استفاده از رازیانه در کشت بافت……………………………………………………………………..   40 2-2- تحقیقات کشت بافت  بر روی گیاهان دیگر………………………………………………………………….. 43 فصل سوم:  محل انجام آزمایش…………………………………………………………… 46 3-1- مواد شیمیایی………………………………………………………………………………………………… 47 3-2- تهیه بذر……………………………………………………………………………………………………….. 47 3-3- محیط کشت، ترکیبات و چگونگی آماده سازی آن        ………………………………………………..   . . 47 3-4- تهیه محلول مادری MS(غلظت x10) ………  ……………               ……………………  47 3-5- مراحل سترون سازی………………………………………………………………………………………….. 51 3-5-1- سترون سازی بذرها………………………………………………………………………………………… 51 3-5-2- سترون سازی محیط و وسایل کار………………………………………………………………………… 52 3-5-3-  تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف …………………………………………………………..  52 3-6- کشت گیاه در محیط  های تیماری به منظور کال زایی…………………………………………………….. 54 3-7- باززایی…………………………………………………………………………………………………………. 57 3-8- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع……………………………………………………… 58 3-9- جداسازی ترکیبات فرار………………………………………………………………………………………. 58 3-10- آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………   59  فصل چهارم:  نتایج و بحث 4-1- نتایج کالوس سازی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف…………. 61 4-2- نتایج باززایی ریزنمونه های  گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف………………….. 65 4-3- نتایج حاصل از اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه.. 70 4-4- بررسی ترکیبات شیمیایی گیاه رازیانه تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی از طریق کشت سوسپانسیون سلولی   74…………………………………………………………………………. 4-5- مقایسه درصد سطوح ترکیبات شیمیایی مشترک حاصل از کشت سوسپانسیونی گیاه رازیانه در تیمارهای مختلف هورمونی ……………………………………………………………………………………………………………………….  75 4-6- اشکال طیف گاز کروماتورگراف در اسانس گیاه رازیانه تیمارشده با ترکیبات هورمونی مختلف…………………….77                 فصل پنجم:  بحث و نتیجه گیری کلی    …………………………………………………………………………………………………………      81 بحث…………………………………………………………………………………………………………… 82 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………….. 86 منابع ……………………………………………………………………………………………….   87 چکیده انگلیسی 98………………………………………………………………   ………………….

• مقدمه

گل ها و گیاهان، خاموش ترین موجودات و در عین حال گویاترین مظهر قدرت و عظمت آفرینش هستد. هر برگی از این موجودات زیبا، كتاب بزرگی در وصف توحید است. گل­ها و گیاهان نه تنها با الوان و اشكال بدیع و بی­بدیل خود سفره­ی طبیعت را زینت می­بخشند بلكه آن را چنان سرشاری از نیروی حیاتی می­سازند كه هیچ بساطی را یارای رقابت با آن نیست (امیدبیگی، 1377 .(  با آن كه امروزه درمان بیماری­ها بیشتر از طریق مصرف داروهایی صورت می­گیرد كه منشأ صنعتی دارند و اختصاصاً در آزمایشگاه­ها تهیه می­شوند ولی مصرف بعضی از آن­ها زیان­هایی به بدن می­رساند و عوارض جانبی بسیاری از آن­ها ثابت شده است. در اوایل قرن حاضر پیشرفت علم شیمی و كشف سیستم­های پیچیده­ی سنتز ارگانیك منجر به توسعه­ی صنعت داروسازی و جایگزینی شیمی درمانی شد. بدین طریق پزشكی مدرن توانست بسیاری از بیماری­ها غیرقابل علاج و غالباً مرگ­آور را درمان كند. با وجود این گیاهان دارویی و داروهایی كه از آن­ها تهیه می­شدند هرگز به طور كامل كنار گذاشته نشدند. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی امروزه بیش از 80 درصد مردم جهان (نزدیك به 5 میلیارد نفر)، برای درمان بیماری­ها هنوز از داروهای گیاهی استفاده می­كنند. تقریبا یك چهارم داروهای تهیه شده­ی دنیا  منشأ گیاهی داشته كه یا مستقیماً از گیاهان عصاره­گیری شده و یا براساس تركیب گیاهی، سنتز شده­اند. واژه گیاهان دارویی تنها به تسكین دهنده آلام اطلاق نمی­شود بلكه این گیاهان در زیر گروه غذا به عنوان طعم دهنده­ها، نوشیدنی­ها، شیرین كننده­ها، رنگ طبیعی بوده همچنین به عنوان ماده اولیه محصولات آرایشی و بهداشتی نیز مورد استفاده قرار می گیرند (امیدبیگی، 1376). درواقع گیاهانی كه حداقل دارای صفات زیر باشند،گیاه دارویی نامیده می­شوند: 1- در پیكر این گیاهان مواد ویژه ای به عنوان مواد مؤثر یا متابولیت­های ثانویه ساخته و ذخیره می­شوند كه برای مداوای برخی از بیماری­ها مورد استفاده قرار می­گیرند.  مواد مذكور طی فرآیندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی و به مقدار بسیار كم (به طور معمول كمتر از یك درصد وزن خشك گیاه)، ساخته می­شوند. 2-  اغلب ممكن است اندام ویژه­ای چون ریشه، برگ­ها، ساقه، گل، میوه و غیره بیشترین مواد مؤثر را داشته باشند، بنابراین همیشه نمی­توان كل اندام گیاه را منبع ماده دارویی ویژه­ای دانست. 3- اندام گیاهی برداشت شده، آماده سازی و فرآوری می­شوند، یعنی تحت تأثیر عملیات ویژه­ای مانند جداسازی، خرد شدن، خشك كردن، تخمیر و غیره قرار گرفته و سپس استفاده می­شوند. به طور معمول این اندام­ها به صورت سنتی و فقط با خشك كردن به عنوان  کالای عطاری عرضه می­شوند. جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران رویكرد روز افزون استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده­های حاصله از آن نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی پررنگ­تر كرده است. طوریكه مصرف روبه تزاید آن تنها به كشورهای در حال توسعه  اختصاص نداشته، بلكه یكی از فاكتورهای مهم بهداشتی كشورهای پیشرفته نیز محسوب می­گردد. در جهان 130 میلیون تن گیاه دارویی سالانه خرید و فروش می­شود و حدود یك میلیون كارخانه دارویی در چند سال اخیر افزایش یافته است. طبق برآوردهای صورت گرفته در سال­های اخیر، ارزش بازارهای جهانی داروهای گیاهی كه شامل گیاهان دارویی و فرآورده­های آنها است،  رشد قابل توجهی داشته است. بخش اعظم بازار گیاهان دارویی دنیا، به تولید و عرضه متابولیت­های ثانویه مشتق از این گیاهان مربوط می­شود. متابولیت­های ثانویه معمولاً از ارزش افزوده بسیار بالایی برخوردارند به طوریكه ارزش فروش برخی از این تركیبات مانند شیكونین[1] ، دیجیتوكسین[2]  و عطرهای همچون روغن جاسمین[3] ، از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر كیلوگرم تغییر می كند. همچنین قیمت هر گرم از داروهای ضد سرطان گیاهی مانند وین بلاستین[4] ، وینكریستین[5] ، آجمالیسین[6]  و تاكسول[7]  به چند هزار دلار می­رسد. تاكسول یكی ازتركیبات دارویی است كه از پوست درخت سرخدار به دست می­آید و در درمان سرطان­های سینه و تخمدان مورد استفاده قرار می­گیرد. ورود دارو بودجه زیادی را به خود تخصیص می­دهد این در حالی است كه ایران با داشتن خصوصیات اكولوژیكی و اقلیمی متنوع، یكی از كشوهای كم نظیر در تولید گیاهان مختلف می­تواند باشد به طوری كه ایران از 13 اقلیم موجود در جهان، 11 اقلیم را به خود اختصاص داده است. و به تقریب 8000 گونه گیاهی كه معادل 2 برابر فلور كل اروپا است ازدیگر ویژگی­های كشورمان می باشد، كه این بانك ژن اهمیت اقتصادی زیادی دارد. برای مثال كشور فلیپین حجم عظیمی از درآمد خود را از فروش گیاهان دارویی و گیاهان وحشی به دیگر كشورها بدست می­آورد (میرجلیلی، 1382). بنابراین، اگرچه در زمینه توسعه صنعت گیاهان دارویی در ابتدای راه هستیم، ولی می­توانیم با برنامه­ریزی صحیح، بخش قابل توجهی از بازارهای جهانی را به خود اختصاص دهیم. شاید در ابتدای كار نتوانیم با كشورهایی كه محصولات خود را به تولید انبوه رسانده اند، رقابت نماییم، اما به لحاظ تنوع گونه­ای و تولید طبیعی گونه­هایی دارویی رقبای چندانی در جهان نداریم و در مواردی حتی بی­رقیب هستیم. همه این­ها منوط به این نكته است كه دارایی­های كشور را بشناسیم و بتوانیم از آن­ها استفاده بهینه نماییم. در این صورت حتی می توان تا 5 درصد از تولید ناخالص ملی را از این طریق تأمین نمود (امیری،2006).