2-1-ویژگی های گیاه شناسیArtemisia annua…………………….

2-1-1-گیاهشناسی تیره آستراسه (کاسنی)……………………………. 16

2-1-2-پراکنش جغرافیایی تیره آستراسه (کاسنی)……………………………. 18

2-1-3-گیاهشناسی جنس آرتمیزیا (درمنه)……………………………. 18

2-1-4-پراکنش جغرافیایی جنس درمنه…………………………….. 19

2-1-5-گیاه شناسی گونه درمنه خزری (Artemisia annua……………………………..

2-1-6-تاریخچه نامگذاری……………………………… 20

2-1-7- ترکیبات شیمیایی سرده درمنه…………………………….. 21

2-1-8- خواص دارویی سرده درمنه…………………………… 22

2-2-متابولیت های ثانویه…………………………….. 26

2-2-1- ترپن ها……………………………. 28

2-2-2- ترکیبات ازت دار……………………………. 28

2-2-3- ترکیبات فنلی……………………………… 28

2-2-3-1- فلاونوئیدها……………………………. 29

2-2-4- نقش متابولیت های ثانویه در گیاهان مولد…………………… 30

2-2-5- بازار جهانی گیاهان دارویی و معطر……………………………31

2-3-معرفی ساختار آرتمیزینین به عنوان یک ترپن مهم……………. 31

2-4- کشت بافت گیاهی……………………………… 33

2-4-1- طرز تهیه ریزنمونه گیاهی……………………………… 33

2-4-1-1- انتخاب ریزنمونه…………………………….. 33

2-4-1-2- تأثیر مواد گیاهی و عوامل فیزیکی در رشد ریزنمونه…….. 33

2-4-2- روش های مختلف کشت بافت گیاهی……………………………… 35

2-4-3- کشت کالوس………………………………. 36

2-4-3-1 کالوس………………………………. 36

2-4-4- هورمونهای گیاهی……………………………… 38

2-4-4-1- اکسین ها……………………………. 38

2-4-4-2- سیتوکنین ها…………………………… 39

2-4-4-3- جیبرلین ها……………………………. 39

2-4-4-5- اسید آبسیزیک………………………………. 40

2-4-4-6- اتیلن……………………………… 40

2-4-5- اسیدهای آمینه، آگار، pHو منبع انرژی……………………………… 40

2-4-6- تمایز سلولی(Cytodifferentation)……………………………. 41

2-4-7- تمایز اندام…………………………….. 41

2-4-7-1- اندام زایی……………………………… 42

2-4-7-2- اندام زایی از بافت کالوس………………………………. 43

2-4-8- کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی……………………………… 48

2-4-9- تولید متابولیت های ثانویه در محیط درون شیشیه ای…………… 49

2-5- تحریک………………………………. 52

2-5-1- محرک ها و فرایند تحریک………………………………. 52

2-5-2- دسته بندی محرک ها……………………………. 52

2-5-2-1- محرک های خارجی…………………………….. 52

2-5-2-2- عوامل داخلی……………………………… 52

2-5-2-4- محرک های زنده…………………………… 53

2-5-3- محرک و انتقال سیگنال…………………………….. 53

2-5-3-1- انفجار اکسیداتیو 1 و اکسیژن فعال 2 ((ROS…………………..

فصل سوم: بررسی منابع

3-1- مروری بر مطالعات کشت بافت در گیاهان دارویی………………. 59

3-2- مروری بر مطالعات کاربرد محرک ها در تولید متابولیت های ثانویه…….. 62

3-3- مطالعات انجام شده در مورد تأثیر محرک بر فعالیت سیستم آنتی اکسیدانی و فعالیت آنزیم لیپوکسی ژناز……. 64

فصل چهارم: مواد و روش ها

4-1- مواد گیاهی مورد استفاده……………………………. 68

4-1-1- کشت ساقه…………………………….. 68

4-1-2- کشت برگ………………………………. 68

4-1-3- تهیه محیط MS به منظور کشت ریشه های مویین…………………. 69

4-1-3-1 طرز تهیه استوک ها……………………………. 69

4-2- محرک های مورد استفاده……………………………. 72

4-2-1- تهیه استوک محرک ها……………………………. 73

4-2-1-1- استوک متیل جاسمونات……………………………… 73

4-2-1-2- استوک سالسیلیک اسید…………………………….. 73

4-3- اندازه گیری میزان پروتئین کل از کالوس…………………. 74

4-4-آسکوربات پراکسیداز……………………………. 75

4-4-1- محاسبه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز………………… 77

4-5- استخراج آرتمیزنین……………………………… 78

4-5-1- آماده سازی……………………………… 78

4-6- طرح و آنالیز های آماری……………………………… 79

فصل پنجم: نتایج

5-1- نتایج حاصل از کشت بافت A.annua………………………..

5-2- نتایج حاصل از باززایی غیر مستقیم گیاه A. annua……………..

5-3- میزان آرتمیزنین در کالوس……………………………… 88

5-4- میزان پروتئین در کالوس گیاه درمنه خزری شاهد و تیمار شده با MJA   و SA در زمان های  مختلف……… 90

5-5- فعالیت آنزیم ASC  در کالوس گیاه درمنه خزری شاهد و تیمار شده با MJA   وSA  در زمان های مختلف………. 91

فصل ششم: منابع

6- منابع…………………………….. 94

چکیده:

آرتمیزنین ترکیبی از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که در اندام های هوایی گیاه درمنه خزری Artemisia annua (خانواده آستراسه) فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهد. کشت ریزنمونه در حضور عوامل محرک، راه مناسبی جهت افزایش تولید متابولیت ها و شناخت بهتر از مسیر سیگنالینگ سلولی، باززایی غیر مستقیم و تولید گیاهانی با میزان آرتمیزنین بالا می باشد. به این منظور در این پژوهش از غلظت های مختلف هورمون در محیط کشت MS جهت کالوس زایی، شامل (0/5, 1, 2 mg/l) BAP و(0/5, 1, 1/5 mg/l) 2,4-D استفاده شد. سپس شاداب ترین کالوس ها ی حاصل از ریزنمونه برگ و ساقه جهت القای باززایی به محیط MS حاوی هورمونهای (0/5, 1 mg/l) BAP , (0/5, 1 mg/l) Kin انتقال داده شد. در این پژوهش به منظور افزایش تولید متابولیت ها از غلظت های مختلف محرک های زنده سالسیلیک اسید (با غلظت های mg/50 ml culture 2و 6) و متیل جاسمونات (با غلظت های  µM50 و 150) استفاده شد و اندازه گیری میزان آرتمیزنین بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتری انجام شد. کالوس های تیمار شده با محرک ها 48 و 120 ساعت پس از اعمال تیمار از محیط سوسپانسیون برداشته شدند. به منظور بررسی مسیر سیگنالینگ منجر به تولید آرتمیزنین روند تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز و تجمع میزان پروتئین بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتری مورد بررسی قرار گرفت. غلظت های مختلف هورمونی در ریزنمونه ساقه اختلاف معنی داری را نشان نداده و بیشترین وزن تر کالوس مربوط به تیمار  1/5 mg/l 2,4-D , 1mg/l BAP در ریزنمونه برگی مشاهده شد. بیشترین درصد باززایی غیر مستقیم، در محیط 1 mg/l Kin ودر ریزنمونه برگ بود. نتایج بررسی کالوس های تیمار شده و شاهد نشان داد که محرک باعث افزایش تولید آرتمیزنین شد. نتایج نشان داد که تیمار با محرک سبب فعال شدن سیستم دفاعی ضداکسنده در گیاه و افزایش تجمع پروتئین و افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در کالوس های تیمار شده می شود.

فصل اول: مقدمه

1-1- مقدمه

امروزه متابولیت های ثانویه[1] به عنوان منبعی برای تولید دارو، افزودنی های غذایی، طعم دهنده ها و درمان بیماری ها به کار می روند (Sairam, R. et al. 2002). قدیمی ترین اطلاعات استفاده از گیاهان به عنوان دارو از سومریان و مصریان مربوط به حدود 1550 سال تا 3 هزار سال پیش از میلاد مسیح می باشد (اصغری، غ ر. 1385). ترکیبات طبیعی را می توان به عنوان ترکیبات راهنما برای طراحی منطقی داروهای جدید، توسعه الگو برداری از سنتز آنها و کشف اثرات درمانی جدید مورد استفاده قرار داد (اصغری، غ ر. 1385). گیاه A.annua منبع یک داروی مهم گیاهی سنتی در چین به نام Qing Hao است که در حدود بیش از 2000 سال به عنوان داروی کاهنده تب استعمال می شده است. ترپنوئیدها و فلاونوئیدهای متعدد استخراج شده از A.annua فعالیت ضد سلولی[2]  مهمی را در هنگام آزمایش روی تومور در انسان نشان داده است. در بین این مواد، آرتمیزین  و کورستاژتین[3]  به عنوان ماده موثر در این فعالیت ضدسلولی مهم اثبات شده اند. همچنین عصاره های استخراج شده از قسمت های هوایی گیاه A.annua که در مجاورت هوا خشک شده اند، دارای فعالیت تعدیل مصونیت از طریق تکثیر لنفوسیت نوع T بوده اند. بر اساس مطالعات انجام شده 24 ترکیب در اسانس گونه A.annua مشاهده شده است. ترکیبات اصلی این اسانس، آرتمیزیا کتون، 1و8- سینئول، پینوکاروون، بتا–سلینن، کامفور و گاما- مورولن می باشند) مینا ربیعی، 1382). یکی از مهمترین ترکیبات دارویی این گیاه، آرتمیزینین[4] از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم[5] عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهند. از آنجا که در گزارشات سازمان بهداشت جهانی موارد مقاوم این انگل به داروهای فعلی نظیر کلروکوئین، سولفادوکسین و پرپمتامین یافت شده، به همین دلیل تولید تجاری و انبوه آن مورد توجه خاصی قرار گرفته استKalyman , D. L. 1985)). عملکرد نسبتاٌ کم [08/1 – 01/0 درصد] این ماده در گیاه محدودیت عمده ای در تولید تجاری آن است. تغییرات در شرایط کشت و محیط رشد در کشت های سلولی و تغییر سطوح هورمون های رشد در کشت بافت به منظور بالا بردن مقدار آرتمیزنین چندان موفق نبوده است و از طرف دیگر به دلیل منابع محدود و مشکلات ساخت مصنوعی – شیمیایی این ماده مورد توجه قرار نگرفته است. به همین دلیل در سالهای اخیر تلاش های زیادی برای افزایش آرتمیزنین از گیاه فوق به کمک الیسیتورها صورت گرفته است(Archana, G. et al. 2002). کاربرد محرک های زنده[6] (مانند: متیل جاسمونات[7] و عصاره مخمر[8]) یک استراتژی مهم در تغییر میزان فعالیت آنزیم های دخیل در مسیر بیوسنتز متابولیت های ثانویه و در نتیجه افزایش تولید آنها می باشد (Zaho, J. et al. 2001).

بنابر این در این تحقیق اثرات محرک های[9] مختلف (متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید[10]) بر تولید آرتمیزنین، تجمع پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز[11] مورد بررسی قرار گرفته است.

2-1- اهداف پژوهش

– معرفی بهترین هورمون جهت کالوس زایی در گیاه درمنه خزری.

– معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.

– معرفی بهترین هورمون جهت باززایی.

– معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.

– معرفی بهترین محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.

– معرفی بهترین غلظت محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.

– بررسی تغییرات میزان پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در برابر محرک.

فصل دوم: کلیات

1-2- ویژگی های گیاه شناسیArtemisia annua

درمنه (A.annua)از دولپه ای ها، راسته Asterales، خانواده Asteraceae و قبیله Anthemedeae  است. گیاهی است یکساله، راست (برافراشته)، بدون کرک یا دارای کرک های پراکنده، ساقه منفرد به ارتفاع 100-30 سانتی متر، برگها 5-3 ×4-2 سانتی متر، دارای دمبرگی بلند، دو بار شانه ای منقسم، پانیکول بسیار بزرگ با شاخه های به طور تقریبی 25 سانتی متر، کلاپرکها متعدد، دمگل دار، واژگون، کروی، نهنج بدون کرک، جام گل لوله ای باز، پنج دندانه ای، زردرنگ می باشد که در گرگان، مازندران و گیلان از پراکنش نسبتا وسیعی برخوردار است.)مظفریان، ولی ا…، 68-1367(

1-1-2- گیاهشناسی تیره آستراسه (کاسنی)[1]

نام لاتین کاسنی از Aster، که یک واژه یونانی به معنای ستاره می باشد مشتق شده است و کمپوزیته، یک نام قدیمی اما هنوز معتبر برای این تیره است که اشاره به نوعی گل آذین مشخص دارد که از ویژگی های تیره آستراسه به حساب می آید (Cronquist 2001).

بزرگترین جنس های این تیره Senecio (1000 گونه)، Vernonia (1000گونه)، Centaurea (700 گونه)، Cousinia (600 گونه)، Helichrysum (550 گونه) و Artemesia (550 گونه) هستند (Wagenitz 1976).

اکثر اعضای تیره کاسنی ساختار علفی دارند، اما تعداد قابل توجهی نیز به شکل درختچه، تاک و درخت دیده می شوند (Judd, Campbell et al. 1999).

فرم رویشی گیاهان این تیره به صورت علفی یا خشبی، یکساله تا چند ساله است.

سیستم ریشه ای آنها راست ریشه[1] با ساقه  مستقیم و دارای برگ های متناوب، غالباٌ با بریدگی های گوناگون است. گل ها به صورت گلهای کناری در کپه های ناجور جنس ماده یا ماده عقیم، گلهای طبقی (لوله ای) نر ماده یا به ندرت ماده یا نر عقیم، عموماٌ ماده یا به تخمدان تقلیل یافته و از نظر عمل نر با لوله ای یا به ندرت لوله ای – نخی شکل، غالباٌ زرد یا به ندرت سبز مایل به قرمز (مظفریان 1387).

جام گل در این تیره سفید، قرمز یا زرد، زبانه ای یا پهن شده نامنظم و 2 تا 3 لوبه یا لوله ای باریک و با شکافهای نامنظم و دندانه دار یا به ندرت کاملاٌ لوله ای است.

میوه ها به صورت فندقه هم شکل یا به ندرت ناجور شکل، 2 تا 10 رگه ای یا 1 تا 3 باله، استوانه ای یا با سطح پشتی- شکمی فشرده هستند. کلاله در گل های این تیره وجود ندارد یا وجود دارد، کاهکی، تاج مانند یا گوشک دار مورب، به ندرت متشکل از فلس های بسیار باریک متعدد است. کیسه های بساک با قاعده دم دار یا به ندرت بدون دم، با رأس زایده دار است. خامه گل سربریده، با رأس قلم موئی، با کلاله خطی کناری است.

2-1-2-پراکنش جغرافیایی تیره آستراسه (کاسنی)

این تیره در سراسر جهان به استثنای قطب جنوب و قطب شمال توزیع شده، ودر مناطق  خشک [1] و نیمه خشک [2] ، عرض های جغرافیایی معتدل ، نیمه گرمسیری و پایین شایعترین پوشش گیاهی است (Valles and McArthur 2000).

3-1-2- گیاهشناسی جنس آرتمیزیا (درمنه)

تا کنون بیش از 500 گونه برای این سرده شناسایی شده است (LI,Jiang et al.2012). فرم رویشی درمنه، علفی یا خشبی و بوته مانند، یکساله دوساله تا چند ساله هستند. دارای سیستم ریشه ای، راست ریشه با ساقه برافراشته یا ایستاده، گاهی افتان و گسترده روی زمین، ساقه ها متعدد، در برخی گونه ها بدون انشعاب است. برگ هامتناوب، بدون کرک یا به اشکال گوناگون کرک دار، کرک ها 2 شاخه، به ندرت ستاره ای یا ساده، در بالا اغلب حاوی کرک های غده ای منقوط بدون پایک، پهنک شانه ای بخش یا شانه ای بریده یا 2 تا 4 بار شانه ای بخش، به ندرت ساده، دندانه دار، قاعده ای ها دمبرگ دار، برگ های ساقه ای اغلب بدون دمبرگ یا دمبرگ کوتاه دارند. گل آذین در گل های جنس آرتمیزیا با شمای عمومی گل آذین پانیکول یا سنبله ای- خوشه ای است.

گل های جنس آرتمیزیا همگی لوله ای، در کپه های جور جنس نر ماده، 5 دندانه ای، تعدادی از گلها عملاٌ عقیم یا در کپه های ناجور جنس کپه ها با گلهای کناری ماده لوله ای نخی شکل، در بالا 2 دندانه ای و گل های مرکزی نر ماده و بارور با رأس 5 دندانه ای یا در کپه های با گل های کناری ماده و گلهای مرکزی عملاٌ نر در بالا 5 دندانه ای. میوه به شکل فندقه، بدون کرک، بدون کاکل، مستعطیلی باریک، کوچک، با جای زخم ناشی از اتصال لوله گل جانبی و ناف قاعده ای جانبی است. (مظفریان. 1387).

[1] Tropical region

[2] Subtropical region

[1]. Tap root

[1]. Asteraceae

[1] Secondary metabolite

[2]Cytotoxic

[3] Quercetagetin

[4]Artemisinin