به منظور بررسی الگوی بیان ژن H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین بذور این گیاه پس از جمع آوری از منطقه پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات داشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از گذشت دو ماه تیمار‏های سرب، جیوه، نقره و کلرید سدیم هر کدام در دو سطح اعمال شدند. سپس در چهار بازه زمانی 0، 6، 48 و 72 ساعت پس از تنش نمونه برداری انجام و سریعا نمونه‏ها در نیتروژن مایع قرار داده و سپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- نگهداری شدند. نتایج نشان داد که فلزات سنگین مختلف تأثیر متفاوتی روی رشد گیاه و میزان بیان ژن Alha1 دارند. بررسی بیان ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که در سطح µM50 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به نقره زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 6 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین در سطح µM 100 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به تیمار نقره در زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 72 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین بیان ژن تحت تأثیر کلرید سدیم در دو غلظت mM 200 و mM 400 در همه زمان‏ها افزایش یافت. همچنین مشاهده شد که مقدار فلزات در گیاه بدون تأثیر بر رشد گیاه افزایش یافت. این نتایج نشان می‏دهد که این گیاه ممکن است فلزات سنگین را بخوبی در خود نگه داشته و در این میان ژن Alha1 نقش مهمی بازی می‏کند. به طور کلی می‏توان گفت که میزان بیان ژن در گیاه تحت تأثیر نوع فلز، غلظت فلز، اندام مورد نظر، زمان تنش و شرایط تنش تغییر می‏کند. فهرست مطالب عنوان صفحه فصل اول مقدمه. 1 1-1- تنش…. 1 1-2- شوری خاک… 1 1-3- اثرات شوری بر گیاهان.. 2 1-4- تنش فلزات سنگین.. 2 1-4-1- سرب.. 4 1-4- 2- جیوه 4 1-4- 3- نقره 5 1-5- ویژگی‏های پروتئین‌های H+-ATPaseغشای پلاسمایی.. 6 1-6- ویژگی‌های گیاه Aeluropus littoralis. 7 1-7- اهداف پژوهش…. 9 فصل دوم مروری بر پژوهشهای پیشین.. 10 2-1- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین.. 10 2-1- 1- سیستم کلسیم/کالمادولین.. 10 2-1-2- نقش هورمون‏ها 11 2-1-3- تنش اکسیداتیو. 11 2-1-4- مسیر MAPK.. 12 2-2- انواع پمپ‌های ATPase. 12 2-3- H+-ATPase و تحمل تنش شوری.. 14 2-4- H+-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین.. 15 فصل سوم مواد و روش‏ها 17 3-1- جمع آوری نمونه‌ها‌ی گیاهی.. 17 3-2- کاشت بذرها 17 3-3- اعمال تیمار. 18 3-4- محلول هوگلند. 19 3-5- اندازه‏گیری میزان عناصر. 20 3-6- طراحی آغازگر. 21 3-7- استخراج دی‏ان‏ا از نمونه‌ی‌ گیاهی با استفاده از روش CTAB تغییریافته‌. 22 3-7-1-تهیه‌ی محلول استخراج. 22 3-7-2- روش کار 22 3-7-3- محلول شستشوی شماره 1. 24 3-7-4- محلول شستشوی شماره 2. 24 3-8- استخراج آر‌ان‌ا 24 3-8-1- روش کار 24 3-9- سنتز رشته اول cDNA.. 26 3-10- واكنش RT-PCRبرای ژن‏های AlHA1و مرجع.. 26 3-11- تهیه ژل آگارز. 27 3-12- بافر( X50) TAE.. 28 3-12-1- محلول Tris 28 3-12-2- محلول اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 28 3-13- همسانه‌سازی قطعه مورد نظر در پلاسمید. 29 3-13-1- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی.. 29 3-13-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α. 30 3-13-3- انتخاب همسانه‌ها 31 3-13-4- کشت شبانه‌ی کلنی‌های مثبت.. 32 3-13-5- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری به روش لیز کردن آلکالاینی.. 32 3-13-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب.. 35 3-14- آنالیز‏های آماری.. 36 فصل چهارم نتایج و بحث… 37 4-1- آنالیز صفات مورفولوژیک… 37 4-1-1- وزن ریشه. 37 4-1-2-وزن ساقه. 39 4-1-3- وزن کل گیاه 40 4-1-4-طول ریشه. 41 4-1-5- طول ساقه. 41 4-1-6-طول کل گیاه 42 4-2- اندازه‌گیری عناصر در گیاه. 43 4-2-1- جیوه 44 4-2-2- سرب.. 44 4-2-3- نقره 45 4-3- کمیت و کیفیت دی‌ان‌ا استخراج شده. 46 4-4- استخراج RNA از برگ گیاه A. littoralis. 46 4-5 – واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR 47 4-6- بررسی بیان ژن Alha1 تحت تنش فلزات سنگین و شوری به روش نیمه کمی.. 48 4-6-1- بررسی اثر سطوح مختلف سرب در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 49 4-6-2- بررسی اثر سطوح مختلف نقره در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 50 4-6-3- بررسی اثر سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 52 4-6-4- بررسی اثر سطوح مختلف جیوه در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 53 4-7- همسانه‌سازی محصول پی‏سی‏آر. 56 4-8 – نتیجه‏ گیری.. 57 4-9- پیشنهادات.. 58 مقدمه 1-1- تنش در محیط‏های طبیعی و شرایط زراعی، گیاهان به دفعات در معرض تنش‏های محیطی قرار می‏گیرند. تنش معمولاً به عنوان یک عامل خارجی که باعث تأثیر منفی بر زندگی گیاه می‏شود تعریف می‏شود. مفهوم واژه تنش همواره با تحمل تنش همراه است که قابلیت گیاه در رو به رو شدن با شرایط نامساعد محیطی است. تطابق و سازگاری به تنش‏های محیطی ناشی از تغییرات در سطوح مختلف اندام‏های موجود زنده از سطح آناتومیک و مورفولوژیک تا سطوح سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی رخ می‏دهد. واکنش‏های سلولی به تنش شامل تغییر در چرخه سلولی و تقسیم سلولی، تغییر در سیستم غشاهای داخلی و واکوئلی سلول و تغییر در ساختار دیواره سلولی است که در تمام این پاسخ‏ها شاهد تغییر الگوی بیان ژن یا ژن‏هایی هستیم است که محصول آن‏ها در تنش مؤثر هستند (Taiz and Zeiger, 1991). 1 -2 – شوری خاک سابقه شوری خاک به اندازه تمدن بشری است و احتمالاً دلیل انقراض تمدن باستانی سومر، شور شدن خاک بوده است (Jacobsen and Adams, 1958). امروزه نیز شوری یکی از تنش‏های غیر زنده مهم به شمار می‏رود که اثرات زیانباری بر عملکرد و کیفیت محصول دارد (Boyer, 1982). در آسیا بیشترین مساحت اراضی شور پس از کشورهای آسیای میانه، هندوستان و پاکستان در ایران قرار دارد. از کل مساحت ایران که 165 میلیون هکتار است، حدود 44 میلیون هکتار آن تحت تاثیر شوری بوده که نزدیک به 30 درصد دشت‏ها و متجاوز از 50 درصد اراضی تحت کشت آبی کشور را تشکیل می‏دهد (Pillaya et al., 2005). منبع اصلی که خاک را شور می‏کند نمک‏های محلولی است که در منابع آب زیر زمینی وجود دارد. برآورد شده است که تقریباً 15 درصد از اراضی ایران تحت تأثیر نمک با درجات مختلف قرار دارد (ملکوتی و همکاران، 1381). شوری خاک و آب‏های کم کیفیت از جمله مشکلات جدی در تولید محصولات کشاورزی می‏باشند. ایران از جمله کشور‏هایی است که با کمبود آب آبیاری و مشکل خاک روبرو است. مشکل شوری به خاطر زیاد بودن تبخیر از سطح خاک، بارندگی کم، پستی و بلندی زمین‏ها، آبیاری با آب دارای کیفیت نامناسب و سنگ‏های نمکی است. عوامل فوق باعث به وجود آمدن شوره‏زار‏های زیادی شده است. در سال‏های اخیر روند شور شدن خاک‏ها افزایش یافته و هکتار‏ها زمین قابل کشت به علت تجمع بیش از حد نمک غیر قابل کشت شده‏اند (Pillaya et al., 2005).