عنوان صفحه چکیده: …………………………………………………………………………………… 1 فصل اول: مقدمات و کلیات 1-1-بیان مسئله …………………………………………………………………………. 3 1-2-اهداف تحقیق ………………………………………………………………………. 4 1-3-فرضیه های تحقیق…………………………………………………………………. 4 1-4- مفهوم نانوتکنولوژی ……………………………………………………………… 5 1-4-1-کاربردهای نانوتکنولوژی……………………………………………………….. 5 1-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی…………………………………………….. 5 1-4-1-2- پزشكی و بدن انسان………………………………………………………….. 6 1-4-1-3- پایداری منابع………………………………………………………………… 6 1-4-1-4- صنایع غذایی…………………………………………………………………. 6 1-5-آنزیم ها……………………………………………………………………………… 8 1-5-1-خصوصیات آنزیم ها…………………………………………………………….. 8 1-5-2- خصوصیات واکنشهای آنزیمی…………………………………………………. 11 1-5-3- پارامترهای موثر بر واکنشهای آنزیمی………………………………………… 14 1-5-3-1- دما……………………………………………………………………………. 14 1-5-3-2-pH ……………………………………………………………………………. 14 1-5-3-3-بازدارنده­ها……………………………………………………………………. 15 1-5-4- سینتیک واکنش آنزیمی…………………………………………………………. 16 1-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعالیت آنزیمها ………………………………………. 17 1-5-5-1-اثر غلظت ماده اولیه برسرعت واکنش آنزیمی………………………………. 17 1-5-6- معادله میکائیلیس- منتن………………………………………………………… 18 1-5-7- معادله لینویور- برک …………………………………………………………… 21 1-5-8- آنزیم لیپاز……………………………………………………………………….. 23 1-5-8-1-كاربرد لیپاز…………………………………………………………………… 25 1-5-8-2- سینتیک واکنش لیپاز………………………………………………………… 27 1-5-8-3-روش های اندازه­گیری فعالیت لیپاز………………………………………….. 28 1-6- تثبیت آنزیم ……………………………………………………………………….. 30 1-6-1- انتخاب پایه و روش مناسب جهت تثبیت آنزیم…………………………………. 31 1-7- کیتین و کیتوسان ………………………………………………………………….. 32 1-7-1- کیتین……………………………………………………………………………. 33 1-7-2- کیتوسان…………………………………………………………………………. 34 1-7-2-1- کاربردهای کیتوسان…………………………………………………………. 35 1-8-تعیین مشخصات نانوذرات کیتوسان ………………………………………………. 38 فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق 2-1- مروری برمطالعات آنزیمی ……………………………………………………….. 41 2-2-مروری بر پیشینه آنزیم لیپاز ……………………………………………………… 42 2-3-تاریخچه تولید کیتین و کیتوسان …………………………………………………… 44 2-4-تاریخچه تثبیت آنزیم روی نانو ذرات ……………………………………………… 45 2-5-تحقیقات پیشین در این زمینه ………………………………………………………. 46 فصل سوم: مواد و روش ها 3-1- مقدمه ……………………………………………………………………………… 51 3-2-مواد شیمیایی ………………………………………………………………………. 52 3-3-وسائل و دستگاه های مورد نیاز …………………………………………………… 54 3-3-1-ظروف آزمایشگاهی…………………………………………………………….. 54 3-3-2-دستگاه­ها…………………………………………………………………………. 54 3-4-روش­های آزمایشگاهی بکار گرفته شده در پایان نامه …………………………….. 58 3-4-1-سنتز نانو ذرات کیتوسان ……………………………………………………….. 58 3-4-2-تثبیت آنزیم لیپاز به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شیف………… 59 3-4-3-تعیین خصوصیات نانو ذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی 60 3-4-4-تعیین توزیع اندازه ذرات نانوکیتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از زتاسایزر 61 3-4-5-طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) …………………………………………….. 62 3-4-6- اندازه­گیری پروتئین تام به روش برادفورد……………………………………… 62 3-4-7-اندازه­گیری مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان………… 63 3-4-8-اندازه­گیری فعالیت آنزیم لیپاز…………………………………………………… 63 3-4-8-1-منحنی استاندارد فعالیت لیپاز…………………………………………………. 64 3-4-8-2-روش اول- اندازه­گیری فعالیت لیپاز به روش کیت پارس آزمون (کیت تشخیصی کمی Lipase DC) در سرم یا پلاسما به روش فتومتریک………………………………………………………. 66 3-4-8-3-روش دوم- اندازه­گیری فعالیت لیپاز با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) 68 3-4-9- بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان 68 3-4-10-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان 69 3-4-11-بررسی پارامتر های سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 69 فصل چهارم: نتایج 4-1-مقدمه ………………………………………………………………………………. 71 4-2-تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) ……………………….. 71 4-3-طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) …………………………………. 72 4-4-توزیع اندازه نانوذرات سنتز شده با استفاده از زتا سایزر …………………………. 74 4-5-فعالیت لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان ……………….. 75 4-6-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 76 4-7-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف …… 77 4-8-بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 78 4-9-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در دماهای مختلف …….. 79 4-10-پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپازسودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 80 فصل پنجم: بحث و نتیجه ­گیری بحث………………………………………………………………………………………. 83 نتیجه گیری ……………………………………………………………………………… 87 مشکلات وپیشنهادات ……………………………………………………………………. 89 منابع و مآخذ……………………………………………………………………………… 90 فهرست منابع فارسی…………………………………………………………………….. 91 فهرست منابع غیر فارسی……………………………………………………………….. 92 چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………… 100 چکیده: لیپازها یکی از مهمترین آنزیم­ها در سیستم­های بیولوژیکی در صنایع مختلف است. کاربرد لیپاز آزاد به دلیل نیمه عمر کمتر در صنایع مقرون به صرفه نیست. تثبیت آنزیم روی پایه­های مختلف باعث افزایش پایداری، استفاده مکرر، سهولت جداسازی محصول، کنترل بیشتر واکنش و هزینه کمتر می­شود. تثبیت آنزیم غالبا بر روی پایه های متخلخل آلی یا معدنی انجام می­شود اما در سال­های اخیر از انواع نانوذرات به دلیل سطح تماس بالا در واحد حجم استفاده شد. هدف از این مطالعه سنتز نانوذرات کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز بطریق کووالان با واسطه گلوتارآلدئید روی نانوذره و مقایسه فعالیت و پارامترهای سینتیکی آنزیم آزاد و تثبیت شده می­باشد. ابتدا نانو ذره کیتوسان در آزمایشگاه سنتز و سپس عملیات تثبیت آنزیم بطریق کووالانسی از طریق واکنش بازشیف انجام شد. و با روش­های میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) و زتا سایزر مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. در مرحله بعد فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده به دو روش کیت تشخیصی پارس آزمون و روش استاندارد پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) اندازه­گیری و پارامترهای سینتیکی Km و Vm تعیین شدند. نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که اندازه نانوذرات کیتوسان کمتر از nm100 است و بر اساس نتایج زتاسایزر اندازه ذرات قبل از تثبیت در محدوده nm300-10 و بعد از تثبیت آنزیم در محدوده nm500-20 بود. همچنین طیف FT-IR لیپاز آزاد و تثبیت شده بترتیب دارای پیک جذبی در طول موج cm-1 1645 و cm-1 9/1646 می­باشند که تثبیت لیپاز روی نانوذرات را تأیید نمود. pH بهینه لیپاز آزاد 7 و تثبیت شده، 5/7 بدست آمد. همچنین لیپاز آزاد در دمای °C30 وتثبیت شده در °C 40 بیشترین فعالیت را نشان داد. اگرچه میزان پایداری و نیمه عمر کمتری در مقایسه با آنزیم تثبیت شده داشت. براساس نتایج مطالعه حاضر می­توان آنزیم لیپاز را بطور کووالان با واسطه گلوتارآلدئید با موفقیت روی نانوذرات کیتوسان تثبیت نمود و آنزیم تثبیت شده دارای فعالیت و خصوصیات سینتیکی مناسبی برای کاربرد در صنایع مختلف است. کلمات کلیدی:نانوکیتوسان، لیپازسودوموناس، تثبیت، فعالیت آنزیم، خصوصیات سینتیکی مقدمات و کلیات 1-1-بیان مسئله: لیپاز آنزیمی است که چربی را به اسید چرب و الکل هیدرولیز می­کند. لیپاز یک آنزیم همه کاره است که کاربرد های صنعتی بسیاری دارد. اما پایداری لیپاز در محیط های مختلف نظیر آنزیم­های دیگر بیش از اندازه پایین می­باشد تا امکان استفاده آن را تحت شرایط سخت که برای کاربردهای صنعتی لازم می­باشد، میسرکند. به علاوه لیپاز گران قیمت است و به لحاظ اقتصادی استفاده از لیپاز به فرم آزاد مقرون به صرفه نیست و چون نیمه عمر آنزیم آزاد کمتر است و قابلیت بکارگیری مکرر آن محدودیت دارد لذا از آنزیم تثبیت شده بر روی بسترهای مختلف استفاده می­کنند. به دلیل قابلیت حل بالای آن در آب نمی­توان از آن مجددا استفاده کرد. بسیاری از تحقیقات استفاده از تکنیک های تثبیت را برای غلبه بر این محدودیت ها مورد بررسی قرار دادند. برای تثبیت آنزیم لیپاز غالبا از پایه های متخلخل آلی استفاده می­شد اما در سال های اخیر از انواع نانو ذرات به دلیل سطح تماس بالا و حجم بالای منافذ که ورود مولکول­های آنزیم را تسهیل می­کند استفاده شده است چون فعالیت و قابلیت بکارگیری مکرر و پایداری عملیاتی آن را افزایش می­دهد. یکی از انواع مناسب حامل های نانو، ذرات کیتوسان می­باشد که یک نوع پلیمر بیولوژیکی است لذا در این تحقیق خصوصیات سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان بررسی خواهد شد. 1-2-اهداف تحقیق : این تحقیق در نظر دارد با بکارگیری کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز قابلیت امکان استفاده مکرر ازاین آنزیم را به وجود آورد لذا مهمترین اهداف تحقیق عبارتند از: 1-مشخص کردن میزان فعالیت آنزیم لیپاز تثبیت شده در مقایسه با آنزیم لیپاز آزاد. 2-استفاده از نانو ذره کیتوسان بعنوان بستر مناسب برای تثبیت آنزیم لیپاز بجای تثبیت آن بر روی پایه های متخلخل آلی که بازده کمتری در مقایسه با حامل های نانو دارند. 3-استفاده مکرر و موثرتر آنزیم لیپاز و نیز کاهش هزینه های انجام فرآیند. 1-3- فرضیه های تحقیق: با توجه به اهداف متصور برای تحقیق حاضر و دستیابی به پاسخ های مناسب برای سوالات مطرح شده فرضیات زیر مورد توجه قرارخواهد گرفت: 1-استفاده از آنزیم لیپاز تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان خصوصیات سینیتیکی مناسب تری نسبت به آنزیم آزاد دارد. 2-نانو کیتوسان بعنوان یکی از بهترین حامل های آلی برای تثبیت آنزیم به شمار می رود. 1-4- مفهوم نانوتکنولوژی[1]: نانوتكنولوژی مطالعه ذرات در مقیاس اتمی برای كنترل آنهاست. هدف اصلی اكثر تحقیقات نانوتكنولوژی شكل‌دهی تركیبات جدید یا ایجاد تغییراتی در مواد موجود است. نانوتكنولوژی در الكترونیك، زیست‌شناسی، ژنتیك، هوانوردی و حتی در مطالعات انرژی بكار برده می شود. نانوتکنولوژی به تولید مواد، قطعات و سیستم های مفید با کنترل آنها در مقیاس طولی نانومتر و بهره برداری از خصوصیات و پدیده های جدید حاصله در آن مقیاس گفته می شود [6]. به عبارت دیگر نانو فناوری به تکنولوژی گفته می شود که کلیه فعالیت ها جهت ایجاد ساختاری ظریف در مقیاس نانو برای تغییر در تک تک اتم­ها و مولکول­ها را شامل می­شود، به طوری که مواد و وسایل جدید با خواص مورد نظر و مطلوب قابل ساختن می­شوند [7]. بدین ترتیب ترکیباتی تولید می­شوند که انتظار می­رود در بازارهای آینده نقش کلیدی بازی کنند. تفاوت اصلی فناوری نانو با فناوری های دیگر در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوری مورد استفاده قرار می­گیرند. البته تنها کوچک بودن اندازه مد نظر نیست، بلکه زمانی که اندازه مواد در این مقیاس قرارمی­گیرد، خصوصیات ذاتی آنها از جمله رنگ، استحکام و … نیز تغییر می­یابد[8]. -4-1-کاربردهای نانو تکنولوژی: امروزه فناوری نانو به طور شگفت آوری در تمامی علوم وارد شده و نقش تعیین کننده ای در مراحل مختلف تولید ایفا می­کند که در زیربه طور مختصر به برخی کاربردهای آن اشاره می­شود: 1-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی: نانو تکنولوژی تغییر بنیانی مسیری است که در آینده، موجب ساخت مواد و ابزار­ها خواهد شد. امکان سنتز بلوک های ساختمانی نانو با اندازه و ترکیب به دقت کنترل شده و سپس چیدن آن­ها در ساختار بزرگتر، که دارای خواص منحصر به فرد باشند، انقلابی در مواد و فرآیند­های تولید آنها، ایجاد می­کند. از مزایای نانوساختارها می­توان به سبکتر، قوی­تر و قابل برنامه­ریزی بودن آنها، کاهش هزینه عمر کاری آنها از طریق کاهش دفعات نقص فنی، ابزار­هایی نوین بر پایه اصول و معماری جدید اشاره کرد ]9[. 1-4-1-2- پزشكی و بدن انسان: رفتار مولكولی در مقیاس نانومتر، سیستم های زنده را اداره می­كند. یعنی مقیاسی که شیمی، فیزیک، زیست­شناسی و شبیه سازی کامپیوتری، همگی به آن سمت در حال گرایش هستند ]10[. فراتر از سهولت استفاده بهینه از دارو، نانوتکنولوژی می­تواند فرمولاسیون و مسیر­هایی برای رهایش دارو، تهیه کند، که توان درمانی دارو­ها را افزایش دهد ]11[. 1-4-1-3- پایداری منابع: می­توان به منابعی همچون كشاورزی، آب، انرژی، مواد و محیط زیست پاك اشاره کرد. گستردگی تعاملات بین این فناوری و علوم جانبی آن­ها، از ویژگی­های کاملا بارز این فناوری جدید است. تقسیم­بندی فناوری نانو در شاخه­ها و رشته­های مختلف بیشتر مربوط به کاربرد محصولات این فناوری در هر رشته می­باشد. در ضمینه مسائل زیست محیطی، غذایی، دارویی نیز استفاده از نانو اجتناب ناپذیر خواهد بود. 1-4-1-4- صنایع غذایی: حوزه­های مختلف كاربردی فناوری نانو در غذا و صنایع غذایی را می توان به پنج دسته زیر تقسیم بندی نمود: الف- بهبود طعم و رنگ: به کمک فناوری نانو توانسته اند در مواد غذایی مختلف خواصی ایجاد کنند که ایجاد احساس طعم و بوی خاص در مصرف کننده می­کند. مثلا تولید سس کم چربی که مزه چربی می­دهد در حالی که چربی ندارد. ب- سلامت غذایی: برای اطمینان از سلامت غذایی، پژوهشگران در پروژه­ای از نانو حسگرهای قابل حمل برای یافتن مواد شیمیایی مضر، پاتوژن­ها وسم­ها در مواد غذایی استفاده کرده­اند، با این کار نیازی به فرستادن نمونه­های مواد غذایی به آزمایشگاه، برای تشخیص سلامت و کیفیت محصول­ها در کشتزار­ها و کشتارگاه­ها نیست. همچنین این پروژه، در حال توسعه به­کارگیری زیست تراشه­های DNA برای کشف پاتوژن هاست. این روش می­تواند در تشخیص باکتری های مضر و متفاوت در گوشت یا ماهی ویا قارچ ­های میوه مؤثر باشد.