دکتر مرتضی خمیری

دکتر صبیحه سلیمانیان­زاد

استاد مشاور:

دکتر سید مهدی جعفری

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود (در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است) تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است) فهرست مطالب: فصل اول: مقدمه و كلیات 1-1- مقدمه و اهمیت موضوع…………………………………………………….. 2 1-2- تعریف مسئله…………………………………………………………………. 4 1-3- اهداف………………………………………………………………………….. 5 1-4- فرضیات………………………………………………………………………… 5 فصل دوم: بررسی منابع 2-1- غذاهای فراسودمند…………………………………………………………… 8 2-2- فراورده های غذایی فراسودمند حاوی میکروب‌های پروبیوتیک…………… 8 2-3- ماست پروبیوتیک……………………………………………………………… 9 2-4- پروبیوتیک‌ها…………………………………………………………………… 10 2-4-1- معیار انتخاب میکروارگانیسم به عنوان پروبیوتیک……………………… 11 2-4-2- اثرات سودمند پروبیوتیک‌ها……………………………………………….. 12 2-5- گونه‌های شناخته شده پروبیوتیک‌ها ……………………………………….14 2-5-1- گونه لاکتوباسیلوس پلانتاروم……………………………………………. 15 2-5-2- لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7……………………………………………… 2-6- فرایند ریزپوشانی…………………………………………………………….. 16 2-6-1- ریزپوشانی پروبیوتیک‌ها…………………………………………………… 19 2-6-2- ساختمان ریزپوشینه………………………………………………………. 20 2-6-3- انواع روش‌های ریزپوشانی………………………………………………… 21 2-6-4- استفاده از روش امولسیون به منظور ریزپوشانی پروبیوتیک‌ها………. 23 2-6-5- کاربرد امولسیون‌های چند گانه در توسعه مواد غذایی سالم………… 25 2-6-6- کاربرد امولسیون دوگانه در ریزپوشانی میکروارگانیسم‌ها…………….. 26 2-6-7- سورفاکتانت‌ها…………………………………………………………….. 27 2-7- مواد مصرفی برای ریزپوشینه‌دار کردن……………………………………… 29 2-7-1- صمغ‌های ژلان و زانتان……………………………………………………. 29 2-7-2- ژلاتین………………………………………………………………………. 30 2-7-3- نشاسته…………………………………………………………………… 30 2-7-4- کاراگینان……………………………………………………………………30 2-7-5- سلولز استات فتالات……………………………………………………… 31 2-7-6- کیتوزان……………………………………………………………………… 31 2-7-8- آلژینات………………………………………………………………………. 31 2-7-9- صمغ فارسی………………………………………………………………. 32 2-8- مروری بر تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی بقاء باکتری‌های پروبیوتیک ریزپوشینه شده  طی نگهداری در ماست…..34 2-9- مروری بر تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی میزان بقاء باکتری‌های پروبیوتیک ریزپوشانی شده نسبت به شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی………….35 2-10- هدف از انجام پژوهش……………………………………………………. 37   فصل سوم: مواد و روش‌ها 3-1- معرفی تجهیزات، موادو میکروارگانیسم‌های مورد استفاده……………. 40 3-1-1- تجهیزات مورد استفاده………………………………………………….. 40 3-1-2- مواد شیمیایی……………………………………………………………. 41 3-1-3- میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………….. 43 3-2- عملیات میکربی…………………………………………………………….. 44 3-2-1- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک………………………………. 44 3-2-2- آزمون‌های بیوشیمیایی به منظور شناسایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 3-3- آنالیز شیمیایی شیرخشک بدون چربی  و صمغ فارسی………………. 46 3-3-1- اندازه‌گیری خاکستر……………………………………………………… 46 3-3-2- اندازه‌گیری رطوبت و ماده خشک………………………………………. 46 3-3-3- اندازه‌گیری چربی………………………………………………………… 47 3-3-3-1- روش سوسكله……………………………………………………….. 47 3-3-3-2- روش ژربر……………………………………………………………….. 47 3-3-4- اندازه‌گیری پروتئین و ازت کل………………………………………………47 3-3-5- اندازه‌گیری اسیدیته برحسب اسید لاكتیك…………………………….. 48 3-5- رسم منحنی رشد…………………………………………………………… 48 3-6- تهیه سوسپانسیون فعال سلولی جهت ریزپوشانی…………………….. 49 3-7- فرایندهای ریزپوشانی……………………………………………………….. 49 3-8- آنالیز رهایش سلول‌ها از ریزپوشینه‌ها……………………………………. 50 3-9- محاسبه‌ی بازده فرایند ریزپوشانی………………………………………… 50 3-10- بررسی مورفولوژی ریزپوشینه‌ها توسط میکروسکوپ  نور.ی………….. 51 3-11- تهیه‌ی ماست پروبیوتیک و ارزیابی خصوصیات میکروبیولوژیکی، فیزیکی و حسی نمونه‌های ماست…51 3-11-1- تهیه ماست پروبیوتیک……………………………………………………. 51 3-11-2- آزمون‌های انجام شده بر روی ماست…………………………………… 53 3-11-3- ارزیابی میزان بقا پروبیوتیک‌ها درطول دوره نگهداری ماست…………. 54 3-12- بررسی میزان بقاء سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده در محیط شبیه‌سازی شده گوارشی….54 3-13- آماده‌سازی عصاره‌های شبیه‌سازی شده گوارشی……………………… 55 3-14- ارزیابی پایداری سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی…..55 3-15- ارزیابی حسی……………………………………………………………….. 55 3-16- آنالیز آماری داده‌ها ……………………………………………………………56 فصل چهارم: نتایج و بحث 4-1- آزمون‌های بیوشیمیایی………………………………………………………. 58 4-2- آزمون‌ها و بررسی‌های شیمیایی…………………………………………… 62 4-2-1- شیرخشک………………………………………………………………….. 62 4-2-2- صمغ فارسی………………………………………………………………… 63 4-3- منحنی رشد باکتری لاکتوباسیلوس پلانتارومA7…………………………… 4-4- فرایندهای ریزپوشانی و پوشش‌دهی………………………………………. 65 4-4-1- شکل ریزپوشینه‌های تولید شده…………………………………………. 65 4-5- میزان بقاء سلول‌های ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در طی دوران نگهداری در دمای 4 درجه سانتی گراد…66 4-6- میزان بقا سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست در طول نگهداری….67 4-7- نتایج ارزیابی مقاومت سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست، قبل و بعد از افزودن به ماست در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی………70 4-8- ارزیابی آزمون های شیمیایی ماست طی زمان نگهداری……………. 74 4-8-1- تغییرات pH……………………………………………………………….. 4-8-2- تغییرات اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک در نمونه‌های ماست…….. 75 4-9- ارزیابی آزمون‌های فیزیکی و کیفی  ماست طی زمان نگهداری……… 77 4-9-1- تغییرات گرانروی………………………………………………………….. 77 4-9-2- تغییرات سفتی و نفوذ ناپذیری بافت ماست…………………………… 78 4-10- ارزیابی خصوصیات حسی ماست………………………………………. 79 فصل پنجم: نتیجه‌گیری 5-1- جمع بندی نتایج کلی……………………………………………………… 82 5-2- پیشنهادات………………………………………………………………….. 83 منابع………………………………………………………………………………..86 چکیده: تحقیقات نشان داده است که اکثر مواد‌غذایی پروبیوتیکی حتی زمانی که در دماهای پایین نگهداری می‌شوند تعداد پروبیوتیک‌های آن‌ها کم می‌شود و این امر باعث می­شود تعداد آنها در زمان مصرف کمتر از حد لازم باشند (CFU/g107). روش­های مختلفی برای افزایش مقاومت باکتری­های حساس پروبیوتیک پیشنهاد شده که از آن جمله می‌توان به ریز‌پوشانی اشاره کرد. در تحقیق حاضر، سلول­های سویه­ی بومی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 که یک پروبیوتیک شناخته شده است، توسط صمغ فارسی و به روش امولسیون دوگانه پوشش داده شد و در بستر ماست اضافه شد. خصوصیات ظاهری این ریزپوشینه­ها توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرارداده شد. میزان بقاء این باکتری به دو صورت آزاد و پوشش داده شده با صمغ فارسی در بستر ماست و به صورت جداگانه در مدت 21 روز نگهداری در دمای 4 درجه سانتی­گراد بررسی شد. طی این مدت تغییرات pH واسیدیته نمونه­ها، خواص حسی، ویسکوزیته و سفتی نمونه­­های  ماست حاوی سلول‌های پوشش داده شده و آزاد نیز مورد بررسی قرار گرفت. در انتهای دوره­ی نگهداری مشخص شد که اثر ریزپوشانی بر زنده مانی باکتری­ها معنی­دار بوده است (05/0p<). در نمونه­ی حاوی میکروب ریزپوشانی شده با صمغ فارسی طی 21 روز انبارمانی در یخچال تنها 8/0 سیکل لگاریتمی از تعداد میکروب وارد شده کاهش پیدا کرده بود و تعداد هنوز بیشتر از CFU/g107 بود. در شرایط شبیه­سازی شده گوارش نیز اختلاف معناداری بین سلول ریزپوشینه و آزاد وجود داشت. pH و اسیدیته تمامی نمونه­ها تغییر معنی‌داری در روزهای اولیه داشت. میزان  ویسکوزیته در طول زمان نگهداری کاهش پیدا کرد و در همین مدت زمان، سفتی بافت افزایش پیدا کرد. خواص حسی نمونه ماست حاوی پروبیوتیک ریزپوشانی­شده دارای اختلاف معنی‌داری با نمونه شاهد بود. به طور کلی نتایج این پژوهش، روش امولسیون دوگانه و صمغ فارسی را پوشش دهنده­ مناسبی برای باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در بستر ماست معرفی کرد و مشخص شد که این روش می­تواند از جمله راهکارهایی برای افزایش بقاء این باکتری در نظر گرفته شود. فصل اول: مقدمه و کلیات 1-1- مقدمه و اهمیت موضوع نقش ترکیبات فعال رژیم غذایی در تغذیه انسان، یکی از مهم­ترین مسائل مورد توجه و تحقیق در زمینه علم تغذیه است. یافته­های پژوهشی در مورد این موضوع، پیامدهای گسترده­ای برای مصرف‌کنندگان، مسئولان بهداشتی، متخصصان تغذیه و هم­چنین تولیدکنندگان، فرآیندکنندگان و توزیع­کنندگان موادغذایی داشته است. شواهد علمی جدید در مورد فواید و خطرات مرتبط با جنبه­های منحصر به فرد ترکیبات رژیم­غذایی، به طور مداوم در حال ظهور و  پیشرفت می­باشند. اثرات بالقوه مواد مغذی و اجزای دیگر در رژیم­غذایی، منجر به تحقق ایده تولید مواد غذایی با ویژگی­های خاصی شده است که فراتر از برآوردن نیازهای اساسی تغذیه­ای، بر عملکرد بدن نیز مؤثر باشند. این عامل توجیه­کننده­ی علاقه­ی زیاد مردم به غذاهای فراسودمند[1] است (بورگاین و همکاران، 2006). موادغذایی که به طور رضایت­بخشی باعث بهبود وضعیت سلامت و یا کاهش خطر ابتلا به بیماری­ها، می­شوند را غذاهای فراسودمند می نامند. این محصولات در حال حاضر، بازار رو به رشدی داشته و یکی از زمینه­های اصلی فعالیت در تولید محصولات جدید است. از آن­جایی که مصرف‌کنندگان بیش از پیش به دنبال غذاهای سالم با ارزش­ بالاتری هستند، محصولات موفق­تر آنهایی هستند که می­توانند ادعا کنند دارای  فواید سلامتی­بخش بیشتری هستند. از آنجا که اثرات مفید مواد غذایی تابعی از ترکیبات فعال در رژیم غذایی (اجزای فراسودمندا) می­باشد، طراحی و توسعه این غذاها نیاز به روش­هایی برای تعریف و بهینه­سازی حضور آنها دارد،  چه با افزایش سهم ترکیبات اولیه با اثرات مفید و چه با محدود کردن ترکیباتی که دارای پیامدهای منفی برای سلامتی هستند. از گذشته غذا نه تنها به عنوان عامل تامین­کننده انرِژی بدن انسان بوده است بلکه به عنوان عاملی برای افزایش سلامت مصرف­کننده نیز، مورد استفاده قرار می­گرفته است. بنابراین، امروزه تحقیقات علم تغذیه، در مواردی از جمله دریافت بهینه مواد مغذی، شناسایی اجزای با کیفیت در ترکیبات موادغذایی و توسعه غذاهایی جدید با عملکرد جدید که همان نقش ترکیبات غذایی در پیشگیری از بیماری­ها با تعدیل سیستم­های فیزیولوژیکی است، توسعه یافته است. اولین تعریف غذاهای فراسودمند را به بقراط نسبت می­دهند با شعار غذا را داروی خود کنید (ریاض. م، 1999). بعد از آن اولین بار در سال 1980،  ژاپن  غذاهایی را که با هدف ارتقاء سلامت مصرف­کننده تولید و فراوری می‌شد، فراسودمند نامید (شاه و همکاران، 2000). امروزه غذاهای فراسودمند به صورت زیر تعریف می­شوند، محصولات غذایی که علاوه بر ارزش تغذیه­ای معمول، مزایای خاص دیگری هم برای سلامتی دارند و یا غذاهایی که حاوی سطوحی از ترکیبات زیست فعال می­باشند که به ارزش غذایی معمول محصول اضافه می­کنند (نازار و همکاران، 2009). این روزها مردم علاقه به مصرف غذاهای سالم­تر، بدون تغییر اساسی در رژیم غذایی خود دارند. این بی­علاقگی مصرف­کنندگان نسبت به تغییر عادات غذایی پیشنهاد می­دهد که بازار بالقوه­ای برای غذاهایی وجود دارد که ارزش تغذیه­ای آنها عوض شده است، ولی خواص حسی آنها تغییر نکرده است (ریاض و همکاران، ‌1999). علاوه بر این علاقه مردم به مصرف غذاها و یا مکمل­های غذایی که به بهبود میکروفلور روده کمک می­کند، بیشتر شده است (ساندوال و همکاران، 2010). در این میان غذاهای پروبیوتیک مهم­ترین غذاهای ارتقاء دهنده سلامت مصرف­کننده می­باشند و در سال­های اخیر آگاهی مردم نسبت به اینکه مصرف پروبیوتیک­ها اثرات مفیدی بر سلامتی دارد، افزایش یافته است (چمپاجن و همکاران، 2007). استفاده از پروبیوتیک­ها در غذاهای فراسودمند و صنایع دارویی رشد زیادی داشته است، به طوری­که 65 درصد از بازار غذاهای فراسودمند را به خود اختصاص داده‌اند (آگوست، 2006). موادغذایی نسبت به داروها حامل بهتری برای پروبیوتیک­ها محسوب می­شوند زیرا مصرف­کنندگان تمایل بیشتری به مصرف غذاهای سودمند نسبت به داروها دارند و غذای پروبیوتیک ارزش غذایی بیشتری نسبت به داروی حاوی پروبیوتیک دارد. باکتری­های پروبیوتیک به این صورت تعریف می­شوند؛ میکروارگانیسم­های زنده­ی غیر بیماریزایی، که وقتی به مقدار کافی مصرف شوند اثرات مفیدی بر سلامت میزبان (که می­تواند انسان یا دام باشد) خواهند داشت (دلا پورتا و همکاران، 2012؛ پیکوت و همکاران، 2000). امروزه محصولات پروبیوتیکی از قبیل سویا، آب­پرتقال، محصولاتی بر پایه­ی غلات و حتی شکلات پروبیوتیک در بازار عرضه می­شوند (رودگرز. س، 2011). عواملی موجب کاهش زنده­مانی پروبیوتیک­ها در موادغذایی می­باشند مثل pH نامطلوب، دما، پتانسیل اکسیداسیون – ­احیا و تولید هیدروژن پراکسید (چاواری و همکاران، 2010؛ آلان و همکاران، 2010)، در نتیجه در بسیاری از محصولات به هنگام مصرف تعداد باکتری به اندازه مطلوب باقی نمانده است. هم­چنین اسید معده و قلیای روده هم در زنده­مانی باکتری­ها موثر است (کاپلا و همکاران، 2007). روش­های مختلفی برای افزایش مقاومت باکتری­های پروبیوتیک حساس پیشنهاد شده از جمله آنها می­توان به انتخاب سویه­های مقاوم به اسید معده، استفاده از بسته­بندی غیر­قابل­نفوذ به اکسیژن یا استفاده از موادی که اکسیژن را مصرف می­کنند مثل آسکوربیک اسید، ایجاد سازش با استرس، دو مرحله­ای کردن تخمیر (اگر محصول تخمیری است)، الحاق باکتری به ریزمغذی­ها مثل اسیدهای آمینه و پپتید­ها و ریزپوشانی اشاره کرد (آلان و همکاران، 2010). ریزپوشانی[2] فرایندی است که سلول­ها در شبکه ریزپوشینه یا در یک غشا قرار می­گیرند. یک ریزپوشینه شامل غشایی نفوذ ناپذیر یا نیمه نفوذپذیر، کروی، نازک و محکم است که اطراف هسته­ی مایع/جامد را پوشانده است که قطر آن بین یک میلی­متر تا چند میکرون متغیر است. پلیمر­های غذایی مثل آلژینات، کیتوزان، کربوکسی متیل سلولز، کاراگینان، ژلاتین و صمغ­ها از جمله صمغ فارسی و صمغ عربی به طور عمده و با روش­های مختلف در ریزپوشانی استفاده می­شوند. چون جمعیت سلول­ها طی فرایند ریزپوشانی تحت تاثیر قرار می­گیرد، ضروری است که اطمینان حاصل شود که تکنیک ریزپوشانی تاثیر منفی بر جمعیت سلولی ندارد. یک روش جایگزین برای حفاظت از باکتری­های پروبیوتیک وارد کردن آنها به امولسیون آب در روغن در آب است. امولسیون دوگانه احتمالا محافظ مناسبی برای باکتری­ها هنگام عبور آنها از محیط معده است و به عنوان کپسولی زیستی[3] برای ریزپوشانی باکتری­ها برای مصارف صنعتی در صنعت لبنیات استفاده می­شود (گنزالس و همکاران). 2-1- تعریف مسئله