مقدمه: بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و مطالعات نشان داده که این عنصر می تواند به عنوان یک ریزمغذی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود. در این پژوهش به منظور درک بهتر از نقش بور، اثر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی حیات، تکثیر، تمایز و فاکتورهای بیوشیمیائی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش­ها: MSCs تا سه پاساژ کشت و برای بررسی توان تکثیر و تمایز در محیط­های کشت فاقد ترکیبات استئوژنیک و واجد ترکیبات استئوژنیک آلوده به اسید بوریک قرار داده شد. در بخش اول که شامل بررسی توانائی تکثیر میشود، توانایی حیات با کمک تست MTT و تریپان بلو در زمانهای 12، 24و 36 ساعت بررسی و دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی­گرم بر میلی­لیتر اسید بوریک و زمان 36 ساعت جهت انجام مطالعه انتخاب گردید. در ادامه، توانائی تکثیر با استفاده از توانایی تشکیل کلونی (CFA) و دو برابرشدگی جمعیتی (PDN)، مورفولوژی سلول ها توسط رنگ آمیزی فلوروسنس، سطح الکترولیت­های سدیم، پتاسیم با استفاده از فلیم فتومتر و میزان کلسیم، میزان فعالیت آنزیم­های LDH، ALP ،AST و ALT توسط کیتهای تجاری ارزیابی شد. در بخش دوم که شامل بررسی توانائی تمایز میشود، تاثیر دوز 6 نانو و میکروگرم بر میلی­لیتر به عنوان دوزهای منتخب در زمانهای 5، 10، 15 و 21 روز بر توانایی زیستی، مورفولوژی، سطح الکترولیتها و فعالیت آنزیم هایLDH ،AST و ALT در سلول ها تمایز یافته بررسی شد. میزان تمایز با استفاده از روش کمی آلیزارین رد، غلظت کلسیم و فعالیت آنزیم ALP مورد ارزیابی قرار گرفته و داده ها توسط روش آماری ANOVA، آزمون tukey آنالیز و p<0/05 به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در سلول های مزانشیم میزان توانایی زیستی در دوز و زمان کم تغییر نمی کند، اما افزایش در هر دو فاکتور زمان و دوز، کاهش فعالیت آنزیم­های متابولیکی و متعاقبا حیات را بدنبال داشت. در سلول­های استئوژنیک فقط در دوز بالا و با گذشت زمان منجر به کاهش توانایی حیات سلولی شد و دوز 6 نانوگرم هیچ اثری بر روی توانایی حیات نشان نداد ضمنا فاکتورهای تمایزی، الکترولیتها و آنزیمهای متابولیکی با افزایش زمان فقط در دوز 6 نانوگرم افزایش یافت. نتیجه گیری: تاثیر اسید بوریک به نوع سلول و شرایط تیمار وابسته است به گونه ای که در این مطالعه نشان داده شد که حساسیت سلول­های مزانشیم نسبت به سلول­های استئوبلاست بیشتر است. علاوه بر این دوز پایین اسیدبوریک دارای تاثیر مثبتی بر روند تمایز استخوان بود، لذا دوزهای پایین اسید بوریک می تواند نقش مفیدی بر سلامت سلول های مزانشیم و تمایز آنها به استئوبلاست داشته باشد. کلید واژه­ها: سلول ­های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیم­های متابولیکی، تمایز فصل اول: کلیات و هدف 1 1-1 سلول­های بنیادی ……………………………………………………………………… 1 1-1- 1 تعریف سلول­های بنیادی………………………………………….. 2 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی……………………. 3 1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ………………………………………………………. 4 1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا …………………………………………………….. 4 1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی………………………………………………… 6 1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف……………………………………….. 7 1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان……………………….. 10 1-1-5 سلول­های مغز استخوان ………………………………. 10 1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز………………………….. 11 1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان…………………………….. 12 1-2 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ……………………………….. 13 1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم ………………………….. 14 1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………….. 15 1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم ……………………. 16 1-3 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ……………….. 17 1-3-1 ترمیم استخوان ………………………………………………. 17 1-4 بافت استخوان …………………………………………….. 20 1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) …………………………….. 21 1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ……………………….. 23 1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ……………………………………………….. 23 1-5-3 دوباره­سازی استخوان ………………………………………….. 24 1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی …………….. 25 1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ……………………………………………… 25 1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی …………………………………………….. 27 1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان ………………………… 29 1-7 عنصر بور …………………………………….. 30 1-7-1 مشتقات بور ……………………………………………………….. 32 1-7-2 فراوانی عنصر بور ……………………………………… 32 1-7-3 تاریخچه مصرف بور ……………………………….. 33 1-7-4 منابع طبیعی بور………………………………… 34 1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران …………………………………………. 34 1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن ………………………………….. 36 1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها …………………………………………………….. 37 1-7-6 کاربرد بور در دارو ……………………………………………… 37 1-7-7 سرطان ………………………………………………………. 39 1-8 اثرات بور روی استخوان ……………………………………. 40 1-9 بور و خون ……………………………………………………….. 41 1-10 بور در گیاهان ………………………………………………………… 42 1-11 سمیت بور ……………………………………………. 44 1-12 محدوده استفاده بور ……………………………………………… 45 مروری بر مطالعات گذشته ……………………………………… 47 هدف مطالعه …………………………………………………………….. فصل دوم: مواد و روش­ها 50 2-1 انتخاب رت ………………………………………………………………. 50 2-2 جدا سازی وتكثیر سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان ………………………………….. 52 2-2-1 اجرای پاساژ ……………………………… 54 2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ………………………………………. 54 2-3-1 تمایز به استخوان ……………………………………………………………. 55 2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ……………………………… 55 2-4-1 رنگ آمیزی تریپان بلو ……………………………………………….. 57 2-4-2 سنجش تترازولیوم (MTT) ……………………………………………………. 57 2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( ………………………………………………………………….. 58 2-4-2-2 ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم ………………………………………………… 59 2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک ……………………. 60 2-5 انتخاب دوز مورد نظر ……………………………………….. 60 2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم ……………. 61 2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ……………………………… 63 2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ……………….. 62 2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت …………………………………………….. 65 2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی …………………………………………. 65 2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ……………………………… 65 2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ……………………………………… 66 2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری ……………………………………. 66 2-8-2-2 ترانس آمینازها ………………………………… 68 2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز………………………………… 70 2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ……………………………………………… 72 2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک 72 2-8-3-1 رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ……………………….. 73 2-8-3-2 بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده ………………………………… 73 2-8-4 بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( ……………………. 73 2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی ………… 74 2-8-4-1-1 مراحل انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( ………………………….. 75 2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم ….. 76 2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک ………………………….. 81 2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها ………….. فصل سوم: نتایج 82 3-1 الف: نتایج مرحله اول ………………………………… 82 3-1-1 رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم …………………… 82 3-1-2 اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت …………………… 85 3-1-3 بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ……………… 87 3-1-4 نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول …………………………………………….. 89 3-1-5 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …… 91 3-1-6 میزان الکترولیتها………………………………………….. 92 3-2 نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست ………………………….. 92 3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ……………………….. 93 3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های استئوژنیک 96 3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ……………………………….. 97 3-2-3-1 میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ……………………………………………….. 100 3-2-3-2 میزان رسوب کلسیم …………………………………….. 101 3-2-3-3 بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز …………. 101 3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ……………………………………………………….. 103 3-2-3-5 بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ……………….. 103 3-2-3-6 بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک …………………………………………… فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری 105 4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ……………………….. 105 4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها …………………………………………………… 108 4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی ………………………………………………………………… 109 4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …. 113 4-1-4 اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ……………………………………… 116 4-2 اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ……………………………… 116 4-2-1 توانایی زیستی ……………………………………. 119 4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها ……………………………………………. 120 4-2-3 بررسی فاکتورهای استئوژنیک ……………………. 124 4-2-4 بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی ………….. 127 4-2-5 تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی …………………………………………….. 128 4-3 نتیجه گیری ……………………………………………………… 129 4-4 پیشنهادات ……………………………………………………………. فصل پنجم:ضمیمه 131 5-1 روش تهیه محیط کشت …………………………………………………. 131 5-2 تهیه ی فسفات بافر سالین PBS– ……………………………. 132 5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+……………………… 132 5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک ………………………….. 133 5-5 آماده سازی آلیزارین رد …………………………………………… 133 5-6 روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد ……………………………. 133 5-7 تهیه کریستال ویولت ……………………………………… 133 5-8 روش تهیه محلول MTT…………………………………. 133 5-9 روش تهیه بافر شست و شو( ( Tris-Hcl-NaCl………………….. 133 5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر استخراج ( Tris-Hcl) ………… 134 5-11 روش تهیه بافر ARS ………………. 134 5-12 روش تهیه محلول BSA …………………………… 134 5-13 روش تهیه محلول کمپلکس لاوری ………… 135 5-14 روش تهیه بافر استخراج کلسیم …………………………. 135 5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ …. تعریف سلول­های بنیادی به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1). سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1). به دلیل این­که این سلول­ها منشا تولید بقیه انواع سلول­ها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار می­رود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلول­های تخصص یافته را دارد. این سلول­ها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادی تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی می­ماند. سلول­های بنیادی در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاری از سلول­ها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته می­شوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت برای جایگزینی دیگر سلول­ها را دارا می­باشند. وقتی یک سلول بنیادی تقسیم می­شود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادی باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلول­های خونی و … تمایز یابد (1). شکل1-1: توانائی خودنوزائی و پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com) 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند. خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2). 1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها: سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند: الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند. ب) پر توان[5]: این نوع سلول­ها قادر به ساخت غالب یا همه سلول­های فرد هستند. به عنوان مثال سلول­های بنیادی جنینی تحت شرایط خاص می­توانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلول­های جفت نیستند. سلول‌های بنیادی جنینی و سلول‌های پر توان القایی جز این دسته از سلول‌های بنیادی می‌باشند. پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می­‌کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).