(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                           صفحه

خلاصه فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

مقدمه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

فصل اول: کلیات

1-1 تعریف بیماری لیشمانیوز…………………………………………………………………………………………………………… 6

1-1-2 تاریخچه لیشمانیوز در جهان………………………………………………………………………………………………… 7

1-1-3 تاریخچه لیشمانیوز در ایران………………………………………………………………………………………………….. 8

1-2 رده­بندی و طبقه­بندی انگل لیشمانیا………………………………………………………………………………………… 9

1-3 مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا…………………………………………………………………………………… 11

1-3-1-1 مورفولوژی انگل………………………………………………………………………………………………………………… 11

1-3-1-2 شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)………………………………………………………………. 11

1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستیگوت)………………………………………………………………………………………. 12

1-3-2-1 سیر تکاملی انگل………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-3-2-2 سیر تكاملی انگل در بدن حشره………………………………………………………………………………………

 

15

1-3-2-3 پشه خاكی…………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-3-2-4 سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار……………………………………………………………………… 16

1-4  راههای انتقال لیشمانیا به انسان………………………………………………………………………………………………. 18

1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی………………………………………………………………………………………….. 19

1-4-2  انتقال مکانیکی……………………………………………………………………………………………………………………… 19

1-4-3 انتقال از راه خون…………………………………………………………………………………………………………………… 19

1-4-4 انتقال مستقیم……………………………………………………………………………………………………………………….. 19

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 19

1-5-2 لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)……………………………………………………………………… 21

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………………………………………. 22

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………………………………………………. 22

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب… 22

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………… 23

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)…………….. 24

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………………………………………… 24

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا…………………………………………………………………………………………………. 25

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی……………………………………………………………………. 25

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………………………………………… 25

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی………………………………………………………………………… 26

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………………………………….. 26

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………… 27

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی…………………………………………………………………… 28

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار………………………………………………………………………………………. 28

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………………………………………… 28

1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD+4……………………………………………………. 29

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………………………………………….. 30

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل…………………………………………………………………………………………… 30

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………………………… 31

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………………………………………………….. 31

1-7-1-2 کشت انگل………………………………………………………………………………………………………………………… 32

1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل………………………………………………………………………………… 32

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………………………………… 32

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی………………………………………………………. 33

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………………………………………………. 33

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)……………………………………………………. 34

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو…………………………………………………………………………. 35

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………………………………… 35

1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………………….. 37

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

فصل سوم: مواد و روشها

3-1کشت انگل……………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………….. 43

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………………………………………… 43

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌………………………………………………………………….. 44

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل……………………………………………………………………………………………….. 44

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………… 44

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………….. 45

3-1-7. روش كشت انگل…………………………………………………………………………………………………………………… 45

3-1-8. روش شمارش سلولها……………………………………………………………………………………………………………. 46

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل…………………………………………………………………………. 46

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار………………………………………………………………………………………………………… 46

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay………………………………………. 47

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………….. 48

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay……………………………………………… 48

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………………………………………… 50

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………………………………………. 50

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…………….. 52

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )………………………. 53

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………………………………….. 53

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE…………………………………………………………………… 54

3-5-4 آماده­سازی نمونه……………………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود……………………………………………………………………………………………………………. 57

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE………………………………………………………… 58

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250………………………………………….. 59

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:…………………………………………………………………………… 59

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………….. 60

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford………………………………………. 60

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………………………………………. 61

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………….. 62

3-7-1 روش انجام تست L.T.T……………………………………………………………. 63

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T…………………………………….. 64

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………………………………………….. 66

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی……………………………………………………….. 67

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………………………………………… 67

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………. 69

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH……………….. 69

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………………………………………… 69

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………… 70

فصل چهارم: نتایج

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution…………………….. 72

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها………………………………………………………………………. 72

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford……………………………….. 73

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T…………………………………………………………….. 74

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B……………………………………………. 74

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C……………………………………………. 75

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………… 76

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)…………………………………….. 76

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A 77

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………… 79

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی……………………………………………………. 79

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته……………………………………………………………………………………………. 79

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 82

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته…………………………………………………………………………………………….. 83

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 95

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 106

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

عنوان                                                                                                                           صفحه

شکل 1-1. اشکال مختلف انگل های لیشمانیا ………………………………………………………………………………… 11

شکل1-2. پروماستیگوت لیشمانیا (خارج سلولی) …………………………………………………………………………… 14

شکل -1-3. اشکال اماستیگوت و پروماستیگوت …………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-4. پشه خاکی ………………………………………………………………………………………………………………………. 17

شکل1-5. چرخه زندگی لیشمانیا در میزبان مهره دار …………………………………………………………………… 18

شکل 1-6.. اشکال مختلف لیشمانیوز جلدی (سالک) ……………………………………………………………………. 24

شکل 1-7. بلعیده شدن پروماستیگوت لیشمانیا توسط یک سلول ماکروفاژی …………………………….. 28

شکل3-1. شکل شماتیک لام نئوبار …………………………………………………………………………………………………. 48

جدول3-1. جدول تهیه  ژل جدا کننده پایین SDS-PAGE ………………………………………………….. 56

جدول3-1. جدول تهیه  ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE ……………………………….. 57

جدول3-1. جدول تنظیم رقت دستگاه spect ……………………………………………………………………………… 62

شکل 4-1. پروفایل پروتئینی باندهای حاصل از تک­کلون­ها در مقایسه با نمونه لیشمانین استاندارد…………. 74

جدول 4-1. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنB ……………………………………………………. 75

جدول 4-2. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن c……………………………………………………. 76

جدول 4-3. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنی D……………………………… 77

جدول 4-4. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنیM…………………………………………………… 78

جدول 4-5. مقایسه نتایج اندکس تحریکی به دست آمده در حضور نمونه­های آنتی­ژنی تک کلونی

و Con-A…………………………………………………………………………………… 79

نمودار1-4. نتایج میانگین اندکس تحریکی هر یک از تک کلون­ها در تست L.T.T………….. 80

جدول4-6.  میانگین تست­های DTH ،24 ساعته………………………………………………………………………… 81

نمودار 2-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 24 ساعت ………………………………………. 81

جدول4-7.  میانگین تست­های DTH ، 48 ساعته ……………………………………………………………………….. 82

نمودار 4-3. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 48 ساعت ………………………………………. 82

جدول4-8.  میانگین تست­های DTH ،72ساعته ………………………………………………………………………… 83

نمودار 4-4. بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از 72 ساعت …………………………………………. 83

 

 

 

 

خلاصه فارسی
 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­کلون­های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

یافته­ها: اطلاعات نشان دادند که تک­کلون­های جداشده توانایی القاء واکنش­های درون­تنی و برون­تنی قابل مقایسه­ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی­ژن خالص و هموژن را در تست­های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند

کلید واژه: ایمنی سلولی، لیشمانیا ماژور، لیشمانین، تست تکثیر لنفوسیتی، تست های پوستی

 
 

 

 

مقدمه
انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با