فصل اول: کلیات تحقیق.. 1

1-1- شرح مسئله. 2

2-1- ضرورت و اهمیت موضوع تحقیق. 3

3-1- اهداف تحقیق. 3

1-3-1- اهداف کلی.. 3

2-3-1- اهداف جزئی.. 3

4-1- روش تحقیق. 4

5-1- پرسش­های تحقیق. 4

6-1- پیشینه تحقیق. 4

7-1- واژه شناسی.. 6

1-7-1- تعریف لغوی قرائت.. 6

2-7-1- تعریف اصطلاحی قرائت.. 8

8-1- معرفی شیخ طبرسی.. 10

9-1- معرفی اجمالی مجمع البیان فی تفسیر القرآن. 13

 

فصل دوم: گذری بر تاریخچه و جایگاه قراءات در تفسیر مجمع البیان. 15

مقدمه. 16

1-2- پیشینه اختلاف قرائت­ها 18

2-2- جایگاه اختلاف قراءات در تفسیر مجمع البیان. 20

1-2-2- دیدگاه طبرسی درباره­ی قرّاء مشهور قرآن. 21

2-2-2- دلایل سندیت قراءات مشهور از دیدگاه طبرسی.. 25

3-2- تاریخچه کتب اختلاف قراءات.. 26

 

فصل سوم: بررسی دیدگاه­های ویژه­ی طبرسی درباره انواع اختلاف قرائت از بین صاحب نظران علم قرائت    30

مقدمه. 31

1-3- دیدگاه طبرسی درباره انواع اختلاف قرائت­ها 33

1-1-3- اختلاف در اعراب کلمات؛ که تفاوتی در صورت نوشتن و معنای آن­ها پدید نمی­آورد. 33

2-1-3- اختلاف در اعراب که باعث تغییر معنا می­گردد؛ نه صورت.. 34

3-1-3- اختلاف در حروف کلمات؛ که معنا را تغییر می­دهد ولی صورت همچنان محفوظ است.. 36

 

4-1-3- اختلاف حروف که باعث تغییر صورت است؛ نه معنی.. 37

5-1-3- اختلاف کلمه؛ که صورت و معنا را تغییر می­دهد. 38

6-1-3- اختلاف در جلو و عقب بودن کلمات.. 38

7-1-3- اختلاف در زیاد و کمی کلمات.. 38

2-3- بررسی­ها، ویژگی­ها و تحلیل­ها 39

1-2-3- توجه یا عدم توجه به حدیث سبعه احرف.. 39

2-2-3- اختلاف لهجه. 43

3-2-3- توجه به تغییر معنا و یا عدم توجه به آن. 46

 

فصل چهارم: ضوابط و معیارهای شناخت قرائت صحیح از دیدگاه طبرسی در مجمع البیان   48

1-4- ضابطه پذیرش قراءات.. 49

2-4- ضابطه پذیرش قراءات از دیدگاه طبرسی.. 51

1-2-4- مطابقت و سازگاری قرائت دیگر با آیات دیگر. 52

1-1-2-4- صریحاً و با ذکر آیه. 53

2-1-2-4- به طور اشاره و بدون ذکر آیه مورد نظر. 56

2-2-4- هماهنگی با قواعد ادبیات عرب.. 57

3-2-4- هماهنگی با قراءات مشهور. 65

4-2-4- هماهنگی با شعر شعرای عرب.. 68

5-2-4- مطابقت با لغت.. 71

6-2-4- استفاده از روایات.. 74

7-2-4- استفاده از چند معیار با هم. 77

 

فصل پنجم: نقش اختلاف قرائت­ها در برداشت­های تفسیری مجمع البیان. 81

طرح مساله. 82

1-5- تاثیر در حوزه آیات الاحکام. 84

1-1-5- جمع بین دو حکم مختلف (یا جمع بین دو قرائت) 84

2-1-5- ترجیح یک حکم بر سایر احکام. 88

3-1-5- رفع ابهام ظاهری.. 94

4-1-5- تفسیر و توضیح احکام. 95

5-1-5- تاکید و مبالغه بیش­تر در بیان حکم. 99

2-5- تاثیر اختلاف قرائت در برداشت تفسیری طبرسی در سایر حوزه­ها 100

1-2-5- ایضاح، توضیح و تبیین بیش­تر معنای آیه. 101

2-2-5- گسترش در لفظ و معنای آیه. 104

3-2-5- تخصیص در معنای آیه یا تطبیق معانی بر مصادیق. 106

تور مسافرتی تور هند تور ترکیه تور تایلند تور دبی طراحی سایت تور ترکیه ساندویچ پانل تور چین رپرتاژ آگهیاقامت گرجستان بازاریابی ویروسی
جستجو برای:
جستجو …
کلمات کلیدی بیشتر جستجو شده :
فیزیولوژیکیکاهش ارزشمشاور خارجیولی خاصمولفه های سازمانیشکاف نیازها و خواسته های مشتریان

 

دکتر تقی لشکر بلوکی
 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست

عنوان                                                                                                          صفحه

 

فصل یک: کلیات پژوهش

1-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………………….    2

1-2 بیان مسأله………………………………………………………………………………………………………………………………………..     2

1- اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………   5

1-4 ضرورت و اهمیت تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………….       6

1-5 پرسش های پژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………..  9

1-6 تعاریف عملیاتی متغیرها………………………………………………………………………………………………………………….   11

فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………………….    14

2-2 آموزش……………………………………………………………………………………………………………………………………………..    15

2-3 آموزش ضمن خدمت کارکنان ………………………………………………………………………………………………………   16

2-3 انواع آموزش ضمن خدمت کارکنان ……………………………………………………………………………………………..   17

2-3-1 آموزش های ضمن خدمت با توجه به زمان…………………………………………………………………………        17

2-3-2 آموزش ضمن خدمت بر حسب ماهیت…………………………………………………………………………………….   18

2-4  تاریخچه آموزش ضمن خدمت در ایران……………………………………………………………………………………..    19

2-5. تاریخچه آموزش ضمن خدمت کارکنان در وزارت آموزش و پرورش……………………………………….   20

2-6. اهداف آموزش ضمن خدمت کارکنان…………………………………………………………………………………..          21

2-7. اصول آموزش ضمن خدمت کارکنان…………………………………………………………………………….      23

2-8. آموزش و فناوری اطلاعات و ارتباطات…………………………………………….. 24

2-9. روش های آموزشی مبتنی برفناوری اطلاعات و ارتباطات……………………………      25

2-10. تاریخچه فاوا در آموزش پرورش ایران    26       ……………………………………………………………

2-11. فناوری در آموزش 27     …………………………………………………………

2-12. فاوا در آموزش و پرورش برخی از کشورهای دنیا 28      ……………………………………………….

2-13. جایگاه فاوا در آموزش و پرورش ایران29     ……………………………………………………………

2-14. آموزش ضمن خدمت معلمان و فاوا30     ……………….………………………………………………

2-15. فناوری اطلاعات و ارتباطات31     ……………………….………………………………………………

2-16. ضرورت بهره گیری از فناوری اطلاعات و ارتباطات32     ………..……………………………………

2-17. کاربرد های فناوری اطلاعات و ارتباطات33     ………………..…..……………………………………

2-18. کاربرد آموزشی فناوری اطلاعات و ارتباطات34     …………..…..……………………………………

2-19. ارزشیابی آموزش ضمن خدمت کارکنان35     ………………..…..……………………………………

2-20. الگوها و روش های ارزشیابی برنامه آموزش ضمن خدمت37     ………………………………………

2-21. الگوی ارزشیابی اثربخشی کرک پاتریک 39     ………………..…..…………………….……………

2-22. پیشینه تحقیق43         ……………………………………………………………

فصل سوم: روش تحقیق

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………………..   50

3-2 روش تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………….    50

3-3 جامعه آماری……………………………………………………………………………………………………………………………………    52

3-4 ابزارپژوهش…………………………………………………………………………………………………………………………………….     52

3-5 حجم نمونه…………………………………………………………………………………………………………………………………..      53

3-6 روش نمونه گیری……………………………………………………………………………………………………………………….       54

3-7 روش تجزیه و تحلیل داده ها……………………………………………………………………………………………………        54

فصل چهارم: نتایج پژوهش

4-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………….         58

4-2 تحلیل داده های کمی……………………………………………………………………………………………………………..         53

4-3 بررسی نتایج آزمون t تک نمونه ای ومقایسه شاخص های بررسی کیفیت آموزش بر اساس مدل کرک پاتریک ………………………………………………………………………………………………………………………..         72

4-4 تجزیه تحلیل داده های کیفی………………………………………………………………………………………………….        86

فصل پنجم:

5-1 مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 101

5-2. بحث درباره یافته ها……………………………………………………………………………………………………………….         102

5-3 پیشنهادهای پژوهش……………………………………………………………………………………………………………..         131

4-5. محدودیت های پژوهش…………………………………………………………………………………………………………          132

منابع …………………………………………………………………………………………………………………………..           134

 

                                                                فصل اول:

کلیات

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-1. مقدمه:

معلمان به عنوان یکی از اثرگزارترین عناصر در آموزش و پرورش نیاز به آشنایی با فاوا در امر آموزش دارند، آنها باید دانش و اطلاعات لازم را برای رویاروی با فاوا را کسب کرده تا از این طریق بتوانند با تغییر و تحول در عرصه آموزش همراه شده و به بازسازی و نوسازی دانش و معلومات خود بپردازند. آموزش ضمن خدمت یکی از راهکارهای اساسی برای به روزآمد کردن دانش عمومی، علمی و تخصصی معلمان است که متناسب با تحولات علمی و رشد صنایع آموزش و تغییرات در سیستم آموزش است.

در عصر حاضر، رشد و گسترش سریع فناوری اطلاعات و ارتباطات امکان ارتباط سریع و تبادل اطلاعات را بیش از پیش میسر کرده و افراد هر کجا باشند می توانند آخرین اطلاعات مورد نیاز خود را در هر زمینه ای دریافت کنند. بی شک بیشترین تاثیر این فناوری ها بر محیط های آموزشی است. کاربرد این فناوری ها در آموزش می تواند در جهت بهبود آموزش های سنتی به کار آید و از این طریق به ارائه آموزش های تخصصی به شیوه های مدرن پرداخت (عطاران، 1385).

2-1. بیان مسئله:

در سازمان های کنونی در زمینه ارزشیابی آموزشی مطالعه و تحقیقات اندکی صورت گرفته است، یکی از دلایل عمده این کم توجهی نیز آن بوده است که تعیین دقیق اثرات و نتایج یک دوره ی آموزشی در شرکت کنندگان و تعیین دقیق نحوه عملکرد آنان در بازگشت به محل کار خود در سازمان، فرآیندی است پیچیده، مشکل و گاه مبتنی بر قضاوت های ذهنی کسانی است که هرچند در تهیه و اجرای ظاهرا موفقیت آمیز یک دوره آموزشی کوشش بسیار بعمل آورده اند اما کمتر به آثار نتایج واقعی و عملی دوره آموزشی توجه دارند (ساعتچی،1381).

آموزش هایی که در سازمان های مختلف ارائه می شود می توان در دو طبقه کلی قرار داد: الف) آموزش قبل از خدمت ب) آموزش ضمن خدمت. آموزش قبل از خدمت عبارت است از آن نوع آموزشی که قبل از ورود یا استخدام فرد در سازمان به وی ارائه می شود این نوع آموزش ها عمدتا بر اساس مسائل و مشکلات سازمانی طراحی و اجرا نمی شود بلکه هدف تربیت نیروی انسانی مورد نیاز مشاغل مختلف سازمان می باشد (فتحی واجارگاه،1387: 4). اگر چه در بیشتر موارد در هنگام ورود به سازمان، آموزش های رسمی و نظامداری را از طریق دانشگاه ها یا مؤسسات آموزش عمومی پشت سر گذاشته اند، به علت کلی بودن نوع آموزش ها و نیز ماهیت مشاغل که نوعاٌ نیازمند تخصص و خبرگی ویژه ای است، در هنگام اشتغال، افراد نیازمند گذراندن آموزش های خاصی می باشند؛ به عبارت دیگر همگام با استخدام فرد در سازمان، ماهیت مشاغل، وظایفی که فرد باید در شغل مورد تصدی انجام دهد، ابزارها و وسایل ضروری برای اجرای کار و روش های انجام دادن امور مستلزم آن است که فرد درباره نحوه ی اجرای وظایف محوله، آموزش های ویژه ای را دریافت کند. بنابر این آموزش ضمن خدمت از لحاظ سازمانی به آن نوع آموزشی اطلاق می شود که عموماٌ پس از استخدام فرد در سازمان صورت می پذیرد (فتحی واجارگاه،1390 :5). در پژوهش حاظر دسته دوم، یعنی آموزش های ضمن خدمت، مد نظر می باشد.

آنچه در جامعه اطلاعاتی به خصوص در بخش آموزش و پرورش مورد تاکید است، صرف سرمایه گذاری و کاربرد سخت افزاری و ابزار گونه فناوریهای اطلاعاتی و ارتباطی و استفاده از آن برای انبار کردن اطلاعات نیست، بلکه مساله مهم و اساسی توانمند سازی دانش آموزان در برگزیدن و انتخاب اطلاعات مورد نیاز است. این وظیفه اصلی و مهم معلمان است که دانش آموزان را آماده مواجه با فناوری های جدید کنند (کاستلر[1]، 1995).

فناوری اطلاعات، واسطه ای است که امکان بیان طیف گسترده ای از اطلاعات، اندیشه ها، مفاهیم و پیام ها را فراهم می کند. این پدیده به دلیل برخورداری از ویژگی های متفاوت، دارای تعاریف گوناگونی است. فناوری اطلاعات به مجموعه ای از ابزارها و روش های اطلاق می شود که به نحوی اطلاعات را در اشکال مختلف، جمع آوری، ذخیره، بازیابی، پردازش و توزیع می کند. فناوری اطلاعات در جهت گسترش توانمندی های اندیشه انسان تکوین یافته است. اصطلاح فناوری اطلاعات را میتوان از دو دیدگاه، مورد

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه……………………………………………………………………. 1

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته………………………………………………. 1

1-1 سلول­های بنیادی جنینی……………………………………………………… 3

1-2 سلول­های بنیادی بالغ…………………………………………………………. 4

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان………………………………………………. 5

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی………………… 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی…………… 8

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی…………………………. 10

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی………………………………. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها…17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک…………………………………………………….. 17

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک…………………………………………… 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی…………………………. 20

1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین…………………………. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین……………………………….. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی……………………………………………………. 25

1-6-1 نوروسفر…………………………………………………………………….. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی………………………………….. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق………………………………………………………… 33

فصل دوم: مواد و روش­ها…………………………………………………………… 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی……………………………………….. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ…36

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM…………………………………………….

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH)………………………. 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA…………………………………………………

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان……………… 39

2-2-5 پاساژ سلولی……………………………………………………………… 39

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی………. 39

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71………………………………………………..

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%…………………………………………….. 41

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد…………………………………………….. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%…………………………………………………… 41

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH)……………….. 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول………………………………………………….. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز………………………………………………. 43

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی….44

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی…………… 45

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین……………….. 46

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده …………………………..46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده…………………………….. 48

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز …………………………………………………………49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-)……………… 52

2-6-5 انتخاب پرایمر……………………………………………………………… 53

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها……………………………………………………… 54

2-6-7 واكنش PCR……………………………………………………………….

2-7 آنالیز آماری………………………………………………………………….. 58

فصل سوم: نتایج…………………………………………………………………. 59

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت….59

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز….60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت….60

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی….60

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین……………….. 61

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن…61

4-1 نتیجه ­گیری و بحث………………………………………………………… 70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها…71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی…72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی……74

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت….76

4-5 نتیجه گیری…………………………………………………………………… 77

پیشنهادات…………………………………………………………………………. 77

مراجع ………………………………………………………………………………..79

چکیده:

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­ کنند استفاده شد.

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)  

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­ کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

مقدمه:

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای[1] غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­ کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ[2] تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه ­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن[3] و نامتقارن[4] می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­ کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

همه توان[5]: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

پر توان[6]: از توده سلولی داخلی[7] در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

چند توان[8]: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ[9] و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs)[10] و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

1-1- سلول­های بنیادی جنینی

اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[

این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[

 این سلول­ها از توده سلولی داخلی بلاستوسیس<p><a href="http://40y.ir/%d8%af%d8%a7%d9%86%d9%84%d9%88%d8%af-%d9%be%d8%a7%db%8c%d8%a7%d9%86-%d9%86%d8%a7%d9%85%d9%87-%d8%a7%d8%b1%d8%b4%d8%af-%d8%aa%d9%88%d9%84%db%8c%d8%af-%d9%86%d9%88%d8%b1%d9%88%d8%b3%d9%81%d8%b1-%d8%a7-2/">&nbsp;</a></p><p><a href="http://40y.ir/%d8%af%d8%a7%d9%86%d9%84%d9%88%d8%af-%d9%be%d8%a7%db%8c%d8%a7%d9%86-%d9%86%d8%a7%d9%85%d9%87-%d8%a7%d8%b1%d8%b4%d8%af-%d8%aa%d9%88%d9%84%db%8c%d8%af-%d9%86%d9%88%d8%b1%d9%88%d8%b3%d9%81%d8%b1-%d8%a7-2/"><img class="alignnone wp-image-170857″ src="https://arshadfile.ir/wp-content/uploads/2019/08/6_001-260x300-260x300.png” alt="برای دانلود متن کامل پایان نامه ها اینجا کلیک کنید” width="182″ height="210″ /></a></p>ت جداسازی می­شوند که دارای توانایی تمایز و    تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند، این ویژگی را Pluripotent  می­نامند. محققین اولین بار این سلول­ها را از mice  و اخیرا” از انسان و پریمات­ها جداسازی کرده­اند] 22، 23[. یک نکته مورد توجه در ارتباط با سلول­های بنیادی جنینی موش این است که این سلول­ها پس از آنکه در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی قرار می­گیرند، تکثیر شده و بعد از پیوند به جنین­ در مرحله قبل از کاشته شدن، ویژگی پلوری­پوتنتی خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافت­های تمایز نیافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را تولید کنند ]7، 24[ مشابه همین ویژگی­ها در سلول­های بنیادی جنینی انسان نیز دیده شده است ]7[. بنابراین گرچه سلول­های بنیادی جنینی از قدرت تكثیر و تمایز بالایی برخوردارند اما كاربرد این سلول­ها با موانع اخلاقی و قانونی همراه بوده و پاسخ ایمنی را در فرد گیرنده افزایش می‌دهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتی سلو­ل­های بنیادی جنینی انسان یا موش به حیوانات  متولد شده پیوند زده می­شودند تولید تومور می­ کنند که حاوی انواع متفاوتی از بافت­ها شامل: پوست، مو و عضله می­باشد که تراتوما نامیده می­شود ]25[، حضور سلول­هایی از سه لایه جنینی در این تومور، نشان دهنده ظرفیت تمایزی بالای این سلول­هاست بنابراین استفاده درمانی از این سلول­ها با مشکلاتی همراه است]7[.

2-1- سلول­های بنیادی بالغ

سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و

دکتر تقی لشکر بلوکی
 
 
شهریور 1390
 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 

 

تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

 

 

 

 

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­ کنند استفاده شد.

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­ کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

کلید واژگان: سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر

 

فهرست مطالب

 

 

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه. 1

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته. 1

1-1 سلول­های بنیادی جنینی.. 3

1-2 سلول­های بنیادی بالغ. 4

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان. 5

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک… 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین.. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

1-6-1 نوروسفر. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

فصل دوم: مواد و روش­ها. 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت    a-MEM.. 36

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان. 39

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%. 41

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. 46

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده 46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز 49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52

2-6-5 انتخاب پرایمر. 53

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها 54

2-6-7 واكنش PCR. 54

2-7 آنالیز آماری.. 58

فصل سوم: نتایج… 59

 

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین.. 61

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن 61

4-1 نتیجه­گیری و بحث 70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. 74

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت.. 76

4-5 نتیجه گیری.. 77

پیشنهادات.. 77

مراجع   79

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

شکل 1-1. مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTR  تنظیم می­شود.. 22

شکل 1-2. نوروتروفین­ها و گیرنده­های مربوط با آن:رسپتور تیروزین کیناز و  P75NTR. 23

شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می­شود. 24

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن.. 25

 شکل 1-5 .ارزیابی شکل­ گیری نوروسفر. 26

 شكل 1. تصاویر فاز كنتراست سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط كشت در پاساژهای مختلف. 62

 شكل 2. شناسایی سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. 63

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته   64

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم  MSCs پس از هفته سوم. 65

شکل4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی  66

 شکل 5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین  66

شكل6 A.الگوی بیان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

شكل 6. C الگوی بیان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت).    67

 نمودار 6 A.  مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68

 نمودار6  B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 6

جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین‌دست.. 57

 

مقدمه

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای[1] غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­ کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ[2] تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه ­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن[3] و نامتقارن[4] می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­ کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

همه توان[5]: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

پر توان[6]: از توده سلولی داخلی[7] در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

چند توان[8]: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ[9] و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs)[10] و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل و با فرمت ورد موجود است

متن کامل را می توانید دانلود نمائیدچون فقط تکه هایی از متن پایان نامه در این صفحه درج شده (به طور نمونه)

ولی در فایل دانلودی متن کامل پایان نامه با فرمت ورد word که قابل ویرایش و کپی کردن می باشند موجود است

چکیده

پروتئازهای میکروبی در بین مهم‌ترین آنزیم‌های هیدرولیز‌کننده قرار‌دارند که حدود %60 از بازار جهانی آنزیم‌های صنعتی را به خود اختصاص داده‌اند. در این پژوهش، ستنز آنزیم پروتئاز در فرآیند تخمیر حالت جامد با بهره گرفتن از باکتری Bacillus. licheniformis مورد بررسی قرار‌گرفت. ضایعات و محصولات مختلف کشاورزی شامل سبوس گندم، سبوس برنج، باگاس، پوسته ذرت، آرد‌ذرت و آرد‌جو بعنوان سوبسترا مورد استفاده قرار‌گرفتند. پروتئاز تولیدی از پوسته گندم نسبت به بقیه سوبسترا فعالیت بیشتری نشان داده است. اثر پارامترهای مختلف استخراج شامل نوع و مقدار محلول استخراج کننده و زمان اقامت در شیکر مورد ارزیابی قرار‌گرفت. بیشترین میزان بازیابی پروتئاز با بهره گرفتن از 50 میلی‌لیتر بافر تریس پس از طی مدت 1 ساعت در شیکر بدست آمد. علاوه بر این، تأثیر پارامترهای عملیاتی چون زمان، دما، pH، رطوبت ابتدایی، رطوبت کابین، اندازه ذرات و میزان مایه تلقیح بر تولید آنزیم مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان فعالیت آنزیم پروتئاز پس از 48 ساعت تخمیر، در دمای Cº 35 ، pH ابتدایی برابر 9، رطوبت کابین %90، اندازه ذرات در محدوده cm 2-1 و رطوبت اولیه %200 برای سینی بالایی و %150 برای سینی میانی بدست آمد. همچنین تأثیر مکمل‌های مختلف کربنی و نیتروژنی بر تولید پروتئاز بررسی‌شد. نتایج نشان‌داد که با غنی‌سازی سوبسترا با سبوس برنج (w/w %1) و آرد ذرت ( w/w%2)، بیشترین فعالیت آنزیم پروتئاز بدست‌آمد. حداکثر فعالیت پروتئاز پس از گذشت 48 ساعت، تحت تمامی شرایط مطلوب، میزان فعالیت U/gds 1/1281 و U/gds 7/1048 به ترتیب برای سینی بالایی و میانی بدست آمد. تأثیر دما و pH بر فعالیت و پایداری آنزیم مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که پروتئاز تولیدی ماهیت قلیایی داشته و پایداری بسیار قابل توجهی در محدوده تغییرات دما در بازه Cº 85-30 و مقادیر pH بین 13-7 داشته است و بیشترین فعالیت در مقدار pH برابر 8 و دمای Cº65 حاصل شده است. همچنین کاربرد آنزیم تولیدی در پردازش چرم و هیدرولیز لایه ژلاتین از فیلم‌های عکاسی و همچنین به عنوان افزودنی به شوینده، مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که پروتئاز قلیایی حاصل از B. licheniformis قابلیت بسیار خوبی در حذف لکه‌های مختلف از پارچه، موزدایی از پوست گاو و هضم لایه ژلاتینی از فیلم‌های عکاسی از خود نشان داد. همچنین، تولید آنزیم پروتئاز با بهره گرفتن از فرآیند تخمیر حالت جامد در بیوراکتور و فلاسک بررسی و دو سامانه از نظر میزان تولید آنزیم با یکدیگر مقایسه شدند.

واژه‌های كلیدی: پروتئاز، سبوس گندم، تخمیر حالت جامد، بیوراکتور سینی‌دار، Bacillus. licheniformis

فهرست مطالب

فصل1  1

مقدمه  1

1-1. مقدمه 2

1-2. تعریف آنزیم 2

1-3. تاریخچه آنزیم 2

1-4. ساختار آنزیم 4

1-5. تقسیم‌بندی آنزیم‌ها 5

1-6. تاریخچه آنزیم پروتئاز. 6

1-7. عملکرد پروتئازها 6

1-8. تخمیرحالت جامد 7

1-9. ضرورت انجام پروژه 8

1-10. اهداف این پروژه 8

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی  10

2-1. مقدمه 11

2-2. پروتئازها 11

2-3. منابع پروتئازها 12

2-3-1. پروتئازهای گیاهی. 12

2-3-2. پروتئازهای حیوانی. 13

2-3-3. پروتئازهای میکروبی. 13

2-4. تقسیم بندی پروتئازها 16

2-5. پروتئازهای قلیایی. 19

2-6. مکانیزم عمل پروتئازها 22

2-7. کاربردهای صنعتی آنزیم پروتئاز. 22

2-7-1. صنعت مواد شوینده 23

2-7-2. صنایع غذایی. 24

2-7-3. صنعت چرم 25

2-7-4. صنعت عکاسی. 26

2-7-5. صنایع دارویی. 26

2-7-6. مدیریت محیط زیست.. 27

2-8. تولید آنزیم پروتئاز. 27

2-9. تخمیر حالت غوطه ور. 28

2-9-1. تخمیر حالت جامد 29

2-9-2. مقایسه سیستم‌های تخمیر جامد و غوطه‌ور. 29

2-9-3. انتقال جرم در تخمیر حالت جامد 30

2-9-4. عملیات انتقال جرم در مقیاس ماکرو. 31

2-9-5. عملیات انتقال جرم در مقیاس میکرو. 32

2-9-6. انتقال اکسیژن. 32

2-9-7. نفوذ آنزیم‌ها 33

2-9-8. جنبه‌های انتقال حرارت.. 34

2-9-9. میکروارگانیزم‌های مورد استفاده در تخمیر حالت جامد 35

2-9-10. کاربردهای تخمیر حالت جامد 37

2-9-11. آنزیم‌های بدست آمده از فرآیند تخمیر جامد 38

2-10. طراحی بیوراکتور. 39

2-11. انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد 40

2-11-1. بیوراکتورهای سینی‌دار. 41

2-11-2. بیوراکتورهای بستر‌پرشده 42

2-11-3. بیوراکتورهای استوانه ای‌دوار. 43

2-11-4. بیوراکتورهای بستر‌سیال. 45

2-12. مراحل عمومی برای انجام فرآیند SSF در داخل بیوراکتور. 46

2-13. عوامل مؤثر در تولید پروتئاز در فرآیند SSF در داخل بیوارکتور. 47

فصل3 مواد و روش‌ها 48

3-1. مقدمه 49

3-2. تجهیزات مورد استفاده 49

3-3. تعیین مشخصات سوبسترا 50

3-3-1. محاسبه میزان خاکستر. 50

3-3-2. محاسبه میزان رطوبت.. 51

3-3-3. محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا 51

3-3-4. محاسبه میزان پروتئین. 52

3-3-5. تعیین درصد مواد استخراجی. 54

3-3-6. تعیین درصد سلولز. 54

3-3-7. تعیین درصد لیگنین. 55

3-3-8. تعیین درصد همی‌سلولز. 55

3-3-9. محاسبه اندازه ذرات سوبسترا 55

3-4. میکروارگانیسم و محیط کشت.. 56

3-4-1. انتخاب میکروارگانیسم 56

3-4-2. مشخصات میکروارگانیسم 57

3-4-3. محیط کشت.. 57

3-4-4. تهیه مایه تلقیح. 59

3-4-5. منحنی رشد باکتری. 60

3-4-6. تعیین pH بهینه باکتری. 60

3-5. تخمیر حالت جامد 61

3-6. نمونه‌گیری و استخراج آنزیم از سوبسترای تخمیر‌یافته 63

3-7. فعالیت پروتئاز. 64

3-7-1. منحنی استاندارد تیروزین. 65

3-8. بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار  66

3-8-1. تأثیر نوع سوبسترای جامد 66

3-8-2. تأثیر مدت زمان تخمیر. 67

3-8-3. اثر دما 67

3-8-4. تأثیر pH. 67

3-8-5. اثر پارامترهای مختلف بر روی استخراج آنزیم 68

3-8-6. تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا 68

3-8-7. تأثیر رطوبت داخلی راکتور. 68

3-8-8. تأثیر اندازه ذرات.. 68

3-8-9. تأثیر میزان تلقیح. 69

3-8-10. تأثیر غنی‌سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی. 69

3-8-11. تأثیر pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی. 69

3-8-12. تأثیر دما بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی. 70

3-9. کاربردهای آنزیم تولیدی. 71

3-9-1. افزودنی به مواد شوینده 71

3-9-2. پردازش چرم 71

3-9-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های عکاسی و آزاد سازی نقره 72

3-10. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 72

 

فصل4 نتایج و تفسیر آنها 73

4-1. مقدمه 74

4-2. محاسبه خصوصیات سبوس گندم 74

4-3. منحنی رشد باکتری. 75

4-4. pH بهینه رشد باکتری. 75

4-5. بررسی پارامترهای مختلف بر تولید پروتئاز. 76

4-5-1. تأثیر مدت زمان تخمیر. 76

4-5-2. بررسی تأثیر نوع سوبسترای جامد 78

4-5-3. بررسی پارامترهای مؤثر بر استخراج پروتئاز. 79

4-5-4. تأثیر pH ابتدایی. 82

4-5-5. بررسی دمای داخل بیوراکتور. 82

4-5-6. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا 84

4-5-7. تأثیر رطوبت داخلی بیوراکتور. 85

4-5-8. تأثیر اندازه ذرات.. 86

4-5-9. تاثیر میزان مایه تلقیح. 87

4-5-10. بررسی تأثیر غنی سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی. 87

4-6. بهینه سازی شرایط فعالیت پروتئازی آنزیم 92

4-6-1. تعیین pH بهینه فعالیت آنزیم 92

4-6-2. تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم 94

4-6-3. تعیین pH پایداری آنزیم 95

4-6-4. تعیین دمای بهینه پایداری آنزیم 96

4-7. کاربردهای آنزیم پروتئاز قلیایی حاصل از B.licheniformis 97

4-7-1. عملکرد پروتئاز قلیایی به عنوان افزدونی به شوینده 97

4-7-2. موزدایی از پوست.. 98

4-7-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های X-Ray. 99

4-8. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 100

فصل5 نتیجه‌گیری و پیشنهادها 103

5-1. نتیجه‌گیری. 104

5-2. پیشنهادها 106

فهرست اشکال

فصل1  1

مقدمه  1

شکل1-1. مکانیزم اثر آنزیم بر روی انرژی واکنش.. 3

شکل1-2. شماتیکی از مدل‌های ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (1): مدل قفل و کلید، (2): مدل القایی  4

شکل1-3. نقش پروتئازها در کاتالیز کردن پیوندهای پپتیدی.. 7

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی  10

شکل2-1. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد 32

شکل2-2. بیوراکتور سینی‌دار. 42

شکل2-3. بیوراکتور بسترپرشده بصورت افقی و عمودی.. 43

شکل2-4. بیوراکتور استوانه ای‌دوار. 44

شکل2-5. بیوراکتور بستر‌سیال. 45

فصل3 مواد و روش‌ها 48

شکل3-1. منحنی استاندارد گلوکز. 52

شکل3-2. منحنی استاندارد پروتئین. 53

شکل3-3. تصویر میکروسکوپی از باکتری B. licheniformis 56

شکل3-4. نمایی از بیوراکتور مور استفاده جهت تولید پروتئاز در تخمیر حالت جامد 62

شکل3-5. دیاگرام شماتیک بیوراکتور سینی‌دار. (1) پمپ، (2) نمایشگر و کنترلر دما و رطوبت، (3) نازل                                                                                                  (4) المنت حرارتی، (5) سینی، (6) فن، (7) حسگر دما، (8) حسگر رطوبت.. 63

شکل3-6. نمونه 5گرمی سوبسترای تخمیریافته، (1) : قبل از تخمیر، (2): پس از تخمیر. 64

شکل3-7. منحنی استاندارد تیروزین. 66

فصل4 نتایج و تفسیر آنها 73

شکل4-1. منحنی رشد باکتری.. 75

شکل4-2. تأثیر زمان تخمیر بر روی فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 77

شکل4-3. تأثیر زمان تخمیر بر روی محتوای پروتئین کل. 78

شکل4-4. تأثیر نوع سوبسترای جامد بر فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 79

شکل4-5. تأثیر محلول های مختلف بر استخراج پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 80

شکل4-6. تأثیر حجم بافر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 81

شکل4-7. تأثیر زمان اقامت در شیکر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 81

شکل4-8. اثر pH ابتدایی بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 82

شکل4-9. تأثیر دمای داخل بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 83

شکل4-10. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 84

شکل4-11. اثر رطوبت داخلی بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 85

شکل4-12. تأثیر اندازه ذرات سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 86

شکل4-13. تأثیر میزان مایه تلقیح بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 87

شکل4-14. تأثیر منابع کربنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 89

شکل4-15. تأثیر غلظت های مختلف سبوس برنج بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 89

شکل4-16. تأثیر منابع نیتروژنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 91

شکل4-17. تأثیر غلظت های مختلف آرد ذرت بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 91

شکل4-18. تأثیر pH بر فعالیت آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 93

شکل4-19. اثر دما بر فعالیت آنزیم پروتئاز. 94

شکل4-20. اثر pH بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 95

شکل4-21. اثر دما بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 96

شکل4-22. اثر زمان بر پایداری حرارتی آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 97

شکل4-23. عملکرد پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis بعنوان افزودنی به شوینده، (1) کنترل،                                               (2) اثر شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده، (3) اثر آنزیم و شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده 98

شکل4-24. موزدایی آنزیمی از پوست گاو با بهره گرفتن از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis                                               (1) کنترل (2) نمونه پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق. 98

شکل4-25. هیدرولیز آنزیمی لایه ژلاتینی با بهره گرفتن از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis..                                            (1) کنترل، (2) فیلم عکاسی پس از هیدرولیز آنزیمی. 99

شکل4-26. تأثیر زمان بر تولیدآنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 101

شکل4-27. تأثیر دما بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 101

شکل4-28. تأثیر رطوبت ابتدایی بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 102

شکل4-29. تأثیر محرک‌های پروتئینی مختلف بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 102

فصل5 نتیجه‌گیری و پیشنهادها 103

فهرست جداول

فصل1  1

مقدمه  1

جدول1-1. گروه‌‌های آنزیمی و واکنش‌های مرتبط. 5

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی  10

جدول2-1. پروتئاز‌های قلیایی باکتریایی تجاری، شرکت تولید کننده، منابع و کاربردهای صنعتی  15

جدول2-2. برخی از خواص کارلسبرگ و BPN. 19

جدول2-3. دمای بهینه و پایداری حرارتی پروتئازهای قلیایی حاصل از گونه های باسیلوس.. 20

جدول2-4. pH بهینه پروتئازهای قلیایی تولید شده توسط گونه باسیلوس.. 21

جدول2-5. میکروارگانیسم‌های مورد استفاده در فرآیندهای تخیمری حالت جامد 36

جدول2-6. کاربردهای تخمیر حالت جامد 37

جدول2-7. آنزیم‌های تولید شده در فرآیند تخمیر حالت جامد 38

جدول2-8. انواع بیوراکتورها در فرآیند تخمیر جامد و محصولات تولیدی.. 46

فصل3 مواد و روش‌ها 48

جدول3-1. ترکیب محیط کشت مایع. 58

جدول3-2. ترکیبات مایه تلقیح. 60

فصل4 نتایج و تفسیر آنها 73

جدول4-1. خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سبوس گندم 74

جدول4-2. pH بهینه رشد باکتری.. 76

جدول4-3. تأثیر سبوس برنج (1%) و آرد ذرت (2%) بر تولید پروتئاز در بیواکتور سینی دار. 92

فصل5 نتیجه‌گیری و پیشنهادها 103

فهرست علائم اختصاری

دور بر دقیقه ……………………………………………………………………………………………………………………….rpm